植物组织中的总DNA的提取.doc

渤海大学学生实验报告 课程名称： 任课教师： 实验室名称： 房间号 实验时间： 年 月 日 学院 化学化工与食品安全学院 专业 班级 姓名 学号 同组人 实验项目 组别 实验成绩 实验二 植物组织中总DNA的提取 实验原理 核酸是生物体中的重要成分，核酸以两种方式存在，即DNA和RNA。DNA存在于细胞的特定部位，主要存在于核内即染色体DNA（基因组DNA)，少量存在于细胞质内及细胞器内（mDNA，cpDNA），细胞内各种DNA总称DNA。在生物体内它常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。在制备总DNA时，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白释放出来。同时加入去污剂使蛋白体解析，然后使DNA沉淀与液相中的蛋白质，多糖等杂志分离。 总DNA提取方法很多，从提取原理上看主要有两种：CTAB法和SDS法。 CTAB法：在提取缓冲液中含有一定浓度的CTAB，CTAB能与核酸结合形成复合物，利用氯仿抽取，去除核蛋白，再用异丙醇或无水乙醇沉淀核酸，所得DNA约50kb左右。 一·实验目的 掌握从高等植物组织中提取总DNA的原理，方法。 了解并掌握微量移液器，离心机的使用方法。 二·实验材料 鲜嫩的植物叶片或将植物叶片放入研钵中冷冻-70c超低温冰箱备用 三·实验器材及试剂 实验器材 台式冷冻离心机，水浴锅，微量移液器，研钵，离心管，制冷剂，高压灭菌锅，冰箱，恒温干燥箱，烧杯。离心管架等。 主要试剂 CTAB提取缓冲液 CTAB 2%（w/v） （溶解细胞膜，与核酸形成复合物） NaCl 1.4mol/L （高盐，CTAB—核酸复合物可溶） EDTA 20mmol/L （抑制核酸酶） Tris 100mmol/L （提供生理环境） 氯仿/异戊醇(24:1) RNaseA 10mg/ml -20C保存 无水乙醇或异丙醇 ?-硫基乙醇 76%乙醇+0.2mol/L NaAc 7.1xTE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（ph8.0） 1 mmol/L EDTA(ph8.0） NaAc 3 mol/L 四·实验步骤 取材，破膜，抽提去蛋白质等杂志，沉淀核酸。 取约2g鲜嫩的植物叶片放入研钵，迅速在研钵中加入-196C液氮，将植物组织迅速研磨成粉末后，转入预热的装有3mLCTAB提取缓冲液的离心管中，使之充分混合均匀，与65C水浴保温30min，不时均匀。 以10000rpm离心10min，移上清至另一离心管中。 冷却至室温后，加入等体积（3mL）的氯仿/异丙醇（24:1)进行提取，轻轻地颠倒混匀10mim。 室温下10000rpm离心10min，移上清至另一离心管中弃沉淀。 在上清液中加入2/3体积预冷（-20C）的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，冰浴放置10—20min。沉淀DNA。 室温下10000r/min离心10min，弃上清液。 用1mL预冷的75%乙醇洗涤2次，以除去残留的盐。 37C干燥后（10min），讲沉淀物溶于100uL灭菌去离子水中，转移至1.5mLEppendof管中。 加入RNaseA至终浓度为10ug/ml，37C保温1h。 加入300uL灭菌的去离子水稀释上述样品，增加体积以减少下一步抽取过程中DNA的损失，用等体积的氯仿/异戊醇（24:1）抽取2-3次，室温7000rpm离心10min取上清。5% 上清液中加入1/10体积3mol/LNaAC溶液混匀后，再加入2倍体积的无水乙醇，放置20min后，室温下10000rpm离心10min，沉淀DNA。 用预冷的75%无水乙醇洗2次，37C保温干燥后，溶于0.1xTE中，4C冰箱保存备用。 五·实验现象 六·思考题 植物总DNA提取中应注意什么问题？ 2.植物总DNA提取的原理是什么？ 渤海大学实验报告用纸（第 页 共 页）