常见的生化与分子生物学技术大串讲精品.ppt

基因芯片 基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划的进展而发展起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。 一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯片设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果探测；（5）数据处理和建模。 使用基因芯片对正常细胞和癌细胞进行基因表达分析比较 RNA干扰（RNAi） RNA干扰是指通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达的现象。 miRNA是指微RNA，其长度通常为21nt~25 nt，由内源基因编码，前体含有不完善的发夹结构，能够识别多个目标，通常与目标mRNA的3′-UTR结合，从而阻止它们的翻译，但并不导致目标mRNA的水解。 siRNA是指短干扰RNA，长度也在21nt~25 nt之间，但多数来自外源的双链RNA，作用方式通常为高度特异性的，与目标mRNA结合后，导致它们的降解。 RNAi的作用机制 RNAi的生物学意义——目前普遍认为，它在植物和昆虫体内相当于一种免疫系统，起着保卫基因组的作用，它能够防止外来的有害基因或病毒基因整合到植物基因组中，此外，它还参与基因表达的调控。 miRNA的产生和作用机制 siRNA的产生和作用机制 哺乳动物成熟的红细胞内还有哪些代谢途径？ 哺乳动物成熟的红细胞已经丧失了各种细胞器，因此，那些发生在特定细胞器内的或部分反应发生在特定细胞器内的代谢途径也就不复存在。例如，发生在线粒体内的TCA循环、氧化磷酸化和脂肪酸氧化，发生在细胞核内的DNA复制、DNA转录及其后加工，部分反应发生在内质网的糖异生、发生在内质网上的磷脂合成。被保留的代谢途径主要是对红细胞的功能所必需的两条代谢途径：一条是糖酵解，另外一条是PPP。糖酵解是它获取ATP的唯一手段，通过乳酸发酵维持NAD+的再生，而产生的乳酸通过乳酸循环在肝细胞内重新转变成葡萄糖。PPP是维持其细胞膜的完整性和血红蛋白的血红素铁处于二价态所必需的。 如何计算ATP的得失？ 细胞内许多代谢途径伴随着ATP的消耗或合成。计算一种物质在特殊的条件下的合成或分解能产生或消耗多少ATP已成为许多考试的焦点（例如1分子葡萄糖在破伤风杆菌氧化最多能产生多少ATP或1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的红细胞内产生多少ATP？）。遇到这样的问题，实际上只要全面考虑就行了，需要考虑以下几点：（1）有没有或有多少消耗ATP或其他能量货币的反应？注意其他能量货币与ATP是等价的，另外还要注意ATP是怎样被消耗的，即ATP变成ADP，还是变成AMP？如果是后者，要当成消耗2个ATP才行；（2）有多少产生ATP或其他能量货币的反应？注意ATP合成有底物水平的磷酸化和氧化磷酸化。在考虑氧化磷酸化的时候，要记住线粒体内的1分子NADH或FADH2进入呼吸链分别产生2.5个和1.5个ATP。至于细胞液内产生的NADH如何进入呼吸链取决于它通过何种穿梭系统进入？如果是甘油-3-磷酸脱氢酶穿梭系统，是产生1.5个ATP，否则是产生2.5个ATP；（3）反应系统之中有无干扰ATP产生的化学试剂，例如有无解偶联剂（砷酸或DNP）或呼吸链的抑制剂；（4）反应系统有氧还是无氧？如果有氧要考虑氧化磷酸化，无氧只要考虑底物水平的磷酸化。 对于1分子葡萄糖在破伤风杆菌氧化最多能产生多少ATP的问题，首先需要想到破伤风杆菌是一种厌氧菌，它只能通过糖酵解产生ATP，因此产生的ATP数目是2个。至于1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的红细胞内产生多少ATP的问题要考虑到红细胞没有线粒体，故只能通过糖酵解产生ATP，其次要考虑到砷酸在糖酵解那一步由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的反应中代替无机磷酸以后，形成的甘油酸-1-砷酸-3-磷酸很容易自发水解，而导致后面的底物水平磷酸化不能进行，因此最后产生的ATP数目是为0。 实例 生物大分子生物合成的极性 DNA、RNA、蛋白质、多糖和脂肪酸的生物合成都有一定的方向性，这就是所谓的极性问题。为方便记忆，可以放在一起比较。DNA和RNA合成的方向都是从5′→3′，而蛋白质生物合成的方向总是从N端→C端，阅读mRNA模板的方向也总是从5′→3′，多糖的合成以