第3章媒介生物学基础.ppt

pBC KS +/- pBK-CMV 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括： 人造染色体载体 细菌人造染色体（BAC） 人类人造染色体（HAC） 酵母人造染色体（YAC） 噬菌体人造染色体（PAC） 酵母人工染色体 （Yeast Artificial Chromosomes YAC ) 1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章，报道了构建YAC（Yeast Artificial Chromosome）库的过程。 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体一般含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350-400 kb。 pYAC4 人工染色体含有三种必需成分： 着丝粒、端粒和复制起点。 ? 着丝粒(CEN)位于染色体中央，呈纽扣状结构，在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，也是姐妹染色单体配对时的最后位点，接收细胞信号而使姐妹染色体分开。 ? 端粒（TEL）：主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模板，在染色体端部添加上端粒重复序列，并参与端粒长度和细胞增殖的调控。 复制起点： DNA复制通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于一段长约100bp的DNA上。 YAC的主要缺点1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两 个本来不相连的独立片段；2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发 生缺失或重排；3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色 体具有相似的结构。4．操作时容易发生染色体机械切割。 2 细菌人造染色体 （Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒 的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间， 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 以细菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，又易于分离。科学家用染色体建造法用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS， repE（控制F质粒复制）和parA、 parB（控制拷贝数）等成分。 Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) Bacterial artificial chromosomes are simply plasmids designed for the cloning of very long segments (typically 100,000 to 300,000 bp) of DNA . They generally include selectable markers such as resistance to the antibiotic chloramphenicol (CmR), as well as a very stable origin of replication (ori) that maintains the plasmid at one or two copies per cell. DNA fragments of several hundred thousand base pairs are cloned into the BAC vector. The large circular DNAs are then introduced into host bacteria by electroporation. These procedures use host bacteria with mutations that compromise the