第5讲生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因的电子隆技术.ppt

（三）国际上3大核酸数据库 （含有大量的EST数据） 数据库 (Database) 网址 (Address) EMBL GenBank DDBJ www.ebi.ac.uk/embl /GenBank www.ddbj.nig.ac.jp 国际上三大核酸数据库 EMBL：欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, 其下有European Bioinformatics Centre)，主要位于英国剑桥Cambridge和德国汉堡Hamburg。 GenBank：由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)建立。该中心隶属于美国国家医学图书馆，位于美国家卫生研究院(NIH)内。 DDBJ：日本DNA数据库(DNA Data Bank of Japan）, 由the National Institute of Genetics, NIG主管。 这3个大型数据库于1988年达成协议，组成合作联合体。它们每天交换信息，并对数据库DNA序列记录的统一标准达成一致。每个机构负责收集来自不同地理分布的数据（EMBL负责欧洲，GenBank负责美洲，DDBJ负责亚洲等），然后来自各地的所有信息汇总在一起，3个数据库的数据共享并向世界开放，故这3个数据库又被称为公共序列数据库（Public Sequence Database）。所以从理论上说，这3个数据库所拥有的DNA序列数据是完全相同的。你可以从中选择一个你喜欢的数据库；但是如果你的研究需要实时(24小时以内)的，则要注意这些数据库间的记录是会有差异的。 北京大学生物信息学中心(Centre of Bioinformatics, Peking University): 北京华大基因研究中心： /bgi_new/index.htm 清华大学生物系生物信息研究室： 中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心: 我国主要的相关研究机构 （四）利用EST数据库信息进行电子克隆 利用EST数据库信息进行功能基因的电子克隆是目前最常用的手段。首先选择感兴趣的EST作为查询探针，搜索dbEST数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群(EST contig)为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。 目前利用EST序列拼接获得水稻等植物的完整cDNA的研究已经有一些报道。 例如，南京农业大学的黄骥等以来源于水稻盐胁迫cDNA文库的1个500bp的ESTS121为信息探针搜索位于GenBank的水稻EST库，发现有2个EST与S121部分序列一致，经过拼接组装获得了1个886bp的全长cDNA序列，同源性比较的结果表明其可能编码一个新的水稻锌指蛋白基因，根据拼接好的序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法成功分离了该基因的完整cDNA克隆，命名为OsZFP，该锌指蛋白可能涉及到水稻幼苗的盐胁迫应答反应。 此外，对某种植物来说，除了利用其自身的EST作查询探针外，还可以选择其他物种尤其是亲缘关系较近的物种全长或EST作为查询探针，搜索dbEST库，进而拼接成完整的cDNA序列。其主要理论依据是不同物种同类基因之间存在序列保守性。 唐向荣等发现2个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域(dsRBD)有同源区域，根据同源片段设计引物，用RT-PCR的方法从水稻愈伤组织中扩增得到了1.8kb的cDNA片段，该cDNA含有完整的编码区，有两个典型的dsRBD，与大白菜BcpLH基因的dsRBD在氨基酸水平上相似性为75%左右。 黄骥等以玉米全长6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶cDNA为查询探针，搜索水稻dbEST数据库，发现了几十条高度同源的水稻EST，通过序列组装和拼接获得了1.8 kb左右的cDNA序列，进一步用RT-PCR的方法克隆了水稻的6-磷酸葡萄糖酶基因。 （六）利用基因组信息进行电子克隆 的策略 在GenBank中已经登录了庞大的小鼠、大鼠和人类等多种生物的EST数据资料，所以利用EST拼接它们的全长cDNA序列相对容易些。同时，基因组信息也在迅速增加，如在2002年初，中国华大公司将水稻基因组序列的测序结果无偿地在Internet上公布，供全世界免费使用，这无疑促进了水稻等植物功能基因的电子克隆。 利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制，可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的ES