第3章核酸扩增技术下v148.ppt

主要内容 第一节 聚合酶链反应 第二节 其他PCR相关技术 第三节 实时/荧光定量PCR技术 第四节 PCR产物分析 （一） 荧光染料法 SYBR荧光染料　SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。 （二） 荧光探针法 1．水解探针技术（Taqman技术）　 Taqman探针+UNG酶技术动画 Taqman技术的延伸：TaqMan- MGB探针 将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。 与靶序列退火时，两探针的荧光供体和受体分子紧密相邻，发生FRET产生荧光。荧光强度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。 3．Molecular beacon技术(分子信标法) 4．复合探针法（complex probes） 该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5′端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3′端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5′端杂交。 普通实时荧光PCR仪 离心式实时荧光PCR仪 离心式荧光定量PCR仪结构示意 Roche离心式实时定量PCR仪特点 温度均一性较好； 使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差； 可容纳样品量少，需用特殊毛细管，增加使用成本，不带梯度功能。 第四节 PCR产物分析 PCR扩增产物的检测与分析 凝胶电泳 1．琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同，如表所示： 琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 特点： 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 上样量远大于琼脂糖凝胶； 回收的DNA纯度高(引物纯化)； 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色弱点。 用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。 注意：相关试剂具有神经毒性。 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围 一、PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息 三、 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP） 将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。 PCR-SSCP过程示意 primer ↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓ 1.为正