ＮＡＳＢＡ（依赖核酸序列的扩增）技术.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１）：８０～８５ ＮＡＳＢＡ（依赖核酸序列的扩增）技术 及其在病毒检测中的应用  高闪电　常惠芸 　丛国正　独军政　邵军军　林　彤 （中国农业科学院兰州兽医研究所 国家口蹄疫参考实验室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室　兰州　７３００４６） 摘要　ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）即依赖核酸序列的扩增技术，是一种扩增 ＲＮＡ的新技术，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过 ９～１２ 程。反应在４２℃进行，可以在２ｈ左右将模板ＲＮＡ扩增约１０ 倍，不需特殊的仪器。ＮＡＳＢＡ已 经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测，就 ＮＡＳＢＡ的技术原理及其在病毒检测中的 应用作一综述。 关键词　依赖核酸序列的扩增（ＮＡＳＢＡ）　恒温扩增　病毒检测 中图分类号　Ｑ５２ 　　１９９１年Ｃｏｍｐｔｏｎ报道了一种新的核酸扩增技术— 在非循环相，引物Ｐ１与模板ＲＮＡ退火，ＡＭＶ逆转录酶 依赖核酸序列的扩增技术（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄ 催化合成一条 ｃＤＮＡ链，形成 ＲＮＡＤＮＡ杂交分子， ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＮＡＳＢＡ），该方法是由一对引物介导的、连 ＲＮａｓｅＨ水解杂交分子上的ＲＮＡ，留下一条单链 ＤＮＡ。 续均一的体外特异的对单链 ＲＮＡ进行恒温扩增的过 引物Ｐ２随后与这条ＤＮＡ链的５′末端退火，ＡＭＶ逆转 ９～１２ 录酶催化合成第二条 ＤＮＡ链。Ｔ７ＲＮＡ聚合酶识别双 程，在４２℃条件下２ｈ左右可将模板ＲＮＡ扩增约ｌ０ ［１］ 链ＤＮＡ中的启动子区，催化ＤＮＡ转录为ＲＮＡ，由每一 倍 。ＮＡＳＢＡ具有操作简便、灵敏度高、特异性强等诸 多优点，已广泛应用于病原体、基因异常的检测，肿瘤 分子模板可产生 １００拷贝的ＲＮＡ。新合成的ＲＮＡ进 的诊断和监控、疾病易发性检测、食品的监测、兽疾诊 人循环相，成为反转录的模板。它们首先与引物Ｐ２结 断、水质监控和法医学等领域。 合，由ＡＭＶ逆转录酶催化合成一条 ＤＮＡ链，形成 ＲＮＡＤＮＡ杂交分子，ＲＮａｓｅＨ水解ＲＮＡ，留下一条单链 １　ＮＡＢＳＡ的原理 ＤＮＡ，引物Ｐ１退火，逆转录酶再催化合成一条新的含 　　标准 ＮＡＳＢＡ反应体系中含有 Ｔ７ＲＮＡ聚合酶， 有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子的ＤＮＡ片段，Ｔ７ＲＮＡ聚合酶 ＲＮＡｓｅＨ、禽骨髓白血病病毒（ＡＭＶ）逆转录酶、核糖核 再以此ＤＮＡ为模板成更多拷贝的ＲＮＡ，如此循环反 苷三磷酸（ＮＴＰ）、脱氧核糖核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）、一对特 复，ＲＮＡ拷贝数被不断放大。 殊的引物和缓冲液。引物Ｐ１长约４５个碱基，其３′末 　　把 ＮＡＳＢＡ对 ＲＮＡ序列扩增反应过程加以改变 后，可用于对 ＤＮＡ靶序列的扩增．但是产物仍然是 端大约２０个碱基对与模板的３′末端互补，５′末端含有 ＲＮＡ，反应过程也分为非循环相和循环相两个部分。 能被Ｔ７ＲＮＡ聚合酶识别的启动子序列；引物Ｐ２大约 在非循环相，先对未加酶的反应混合液在 １００℃加热 ２０个碱基长，其序列与模板的５′末端一致。如图１所