第三章分子生物学技术在病理学中的应用2009.ppt

第三章 分子生物学技术在病理学中的应用 第一节?? 原位分子杂交技术 ( in situ hybridization ，ISH ) 核酸分子杂交概述 检测核酸分子间序列同源性的一种技术，主要根据核酸碱基互补的原则（C-G、A-T、A-U）,用已知顺序的核酸片段(DNA或RNA)作为探针，经特殊标记后，与提纯的或组织、细胞中的靶核酸进行杂交，对其进行检测。 核酸分子杂交可以在DNA-RNA、RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。 杂交类型 按其作用方式大致分为固相杂交和液相杂交两种。 液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等 。 固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。 原位分子杂交技术 （In situ hybridization, ISH) 简称原位杂交，指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组化或免疫组化的方法在被测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电镜下显示出目的DNA或RNA在细胞内定位。 可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、细胞印片、涂片上进行杂交，因此能结合病理形态的变化，检出细胞或组织中200-300拷贝以上的核酸序列。 属于固相核酸分子杂交的范畴 区别：菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交；Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Northern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。 基本方法 ①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ②杂交； ③杂交后处理； ④显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色 ； ⑤对照实验和结果的判断 组织固定 目的：形态结构；保存细胞内的DNA，RNA的水平；探针易于进入 DNA稳定，mRNA相对稳定，而RNA则易被酶等降解； 石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。 常用固定剂 1. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 最常用，不与蛋白质产生广泛交联，不会影响探针穿透入组织或细胞，较好的保留RNA； 2. 3:1乙醇冰醋酸 增加探针的穿透性，但不能最大限度保存RNA，对组织有损伤； 3. 戊二醛 较好保存RNA和组织形态，但与蛋白质产生广泛交联，影响探针的穿透性； 玻片和组织切片的处理 盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放 。 粘附剂涂抹玻片 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂Triton X-100或某些消化酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，在用量及孵育时间上应慎为掌握。 减低背景染色 杂交后（Posthybridization ）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。 预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 减低残留的内源性的RNA 防止RNA酶的污染 手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃，最低温度必须在150℃左右）烘烤以达到消除RNA酶的目的。 杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。 核酸分子杂交探针 分子杂交是核酸链间依碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性，利用分子杂交特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中