第三章动物细胞工程制药20130407.ppt

六、组织工程的研究 组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。 第三章习题 离体培养的细胞分为哪些类型？ 什么是接触抑制现象? 动物细胞的生理特点 生产用动物细胞的种类及其特点 动物细胞的培养条件 培养动物细胞的培养基的种类和组成 动物细胞大规模培养的方法 微载体需具备哪些条件？ 动物细胞培养的操作方式 灌流式操作的优点 动物细胞生物反应器必须具备的基本要求 第十节 重组人红细胞生成素生产工艺 1 概述 2 细胞培养工艺 3 分离纯化工艺 一、概述 天然红细胞生成素的发现与种类 理化性质 重组人红细胞生成素及其临床应用 重组人红细胞生成素表达研究 1、天然红细胞生成 1890：现象，低氧压下红细胞增多 1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，EPO）。 形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，166aa，活性类似。 糖基化及其含量不同：EPO-α含有较多的N-乙酰葡糖胺，总含糖量比EPO-β高。 2、EPO的理化性质 大小：166aa 糖链占分子量的39%。 糖基化程度与准确性对活性影响很大。 pI4.2～4.6，对热和pH变化相对稳定。 第一代：两种，rhEPO-α和rhEPO-β。 1989:Amgen,Epogen；1990, Ortho Biotech, Procrit CHO、BHK细胞系生产 第二代：EPO突变体，2001,Amgen,Arasnep长效。 二联体或三联体EPO：高活性，长效（3－5倍） 适应症:肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。隔日注射一次，长效EPO：每周一次。 3、重组人红细胞生成素生产历程 4、rhEPO的表达研究 （1）由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。 （2）SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达红细胞生成素 （3）昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小 （4）干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO。 （5）大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。 （6）家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。 （7）在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。 现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。 4、rhEPO的表达研究 工程CHO细胞系建立 种子细胞制备 反应器培养工艺 培养过程控制 二、 CHO培养工艺 CHO dhfr－细胞 载体：prEC，pDHFR 共转染，筛选稳定表达的细胞系 1、工程CHO细胞系 胰蛋白酶消化，1：5稀释，在含有1 nMMTX培养基上培养，3－4d更换培养基，培养10～14天，至抗性克隆出现。 胰酶消化，1：5稀释，按1 nM→5 nM→25 nM→100 nM→200 nM→1000 nM使MTX浓度逐次升高，筛选抗性克隆。 抗性克隆培养于100 mm培养皿中，按1：500稀释，继续培养3～5天，集落2-4 mm。 酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素。 稳定转染的筛选培养 （1）冻存的细胞株37℃水浴，无菌离心。 （2）加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。 （3）37℃、CO2培养箱培养，连续传三代。 （4）细胞消化后接种，制成接种细胞浓度。 2．种子细胞制备 （1）反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌1.5h。 （2）接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种。 （3）贴壁培养：pH7，50r/min，37℃，DO50-80%。 （4）扩增培养：80－100r/min。 （5）灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。 （6）收获培养物，4℃－8℃保存。 3．灌流培养 （1）搅拌控制：接种后,搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度 （2）温度控制：较为严格，恒定37℃ （3）pH值控制：7.2-7.4,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。 （4）溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体。 （5）葡萄糖控制：流加补料 （6）代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。 4、培养工艺过程控制 初级分离 精制纯化 产品质量控制 三、 rhEPO的分离纯化工艺 收获培养液：离心 过滤：滤膜 亲和色谱：NaCl－Tris平衡，梯度洗脱，收集活性洗脱峰 透析：0.1mM Tris，过夜，换液4