第三章-动物细胞制药.ppt

2、贴壁培养 一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器（由连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂组成，另外，也可以由连续不动的气体和静止不动的固体底物和微生物组成）。 但由于该反应器中传质和传氧常出现梯度式不均一现象，故放大受到限制。 贴壁培养和悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。 一、动物细胞大规模培养的方法 3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养 （1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.030~1.045g/ml）、粒径均一，在60~250?m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。 80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。 一、动物细胞大规模培养的方法 （2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种生物反应器进行大规模培养。 （3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。 二、动物细胞培养的操作方式 1、分批式操作 一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基（conditioned medium），即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。 另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生Namalwa干扰素和疫苗等。 二、动物细胞培养的操作方式 2、半连续式操作 该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。 该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。 二、动物细胞培养的操作方式 3、灌流式操作 该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。 它与连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。 该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。 它的优点是：①细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；④培养基的比消耗率较短，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。 一、动物细胞的培养条件 2、水质 蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M?以上。动物细胞制药用水，要求去热源。 一、动物细胞的培养条件 3、pH pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了部分缓冲体系，可以参考。 一、动物细胞的培养条件 4、渗透压 在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表3-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成/g·L-1。 二、动物细胞培养基的种类和组成 细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。 1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。 2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、ME