第三章基因克隆的酶学基础-2.ppt

分子克隆工具酶及其应用 分子克隆工具酶及其应用 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 第一节 限制性内切核酸酶 5P P5 3HO OH3 核酸酶Bal31的活性 四. 核酸酶S1 1.?一般特点：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH 4.5， 对热稳定，抗变性剂 2.?催化反应类型: ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 3.?用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析 4.?使用注意事项 1) 避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2) 避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口) ExoIII S1 S1 S1 S1 S1 S1 Poly(A) Poly(A) 5 5 5 5 5 5 核酸酶S1活性 五. 绿豆核酸酶 1.??与S1酶相同点：作用于ss-DNA和RNA，对5’-端的突起核苷酸作用速度为GCAT 2.??与S1酶的不同点 最适pH接近中性，不会产生切口; 不使具切口的ds-DNA断裂 3. 用途：与S1酶相同 六. 外切酶Ⅶ 作用于ss-DNA的3’- 与5’-端，产物为低聚核苷酸 除去单链DNA形成平整末端 七. 牛脾磷酸二酯酶 作用含5’-羟基端的ss-DNA和RNA，产生3’-单磷酸核苷 用于短链RNA和 DNA的定序分析 八. 蛇毒磷酸二酯酶 作用3’-羟基单、双链DNA和RNA，产生5’-单磷酸核苷 用于RNA和DNA的定序分析 表4 几种常用外切酶的特点 外切酶 作用方向 作用底物 反应产物 ExoIII 3’→5’ dsDNA 单核苷酸 λ外切酶 5’→3’ ss和dsDNA 同上 Bal31 3’→5’和5’→3’ ss和dsDNA, RNA 同上 S1 3’→5’和5’→3’ ssRNA和ss DNA 低、核苷酸 绿豆核酸酶 3’→5’和5’→3’ ssRNA和ss DNA 同上 Exo VII 3’→5’和5’→3’ ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 5’→3’ ssRNA，ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 3’→5’ ss，ds RNA和DNA 同上 九. RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别序列和特点见表5。 1. RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 十. RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。 表5 核糖核酸酶反应特点 核酸酶 特异性反应 核酸酶 特异性反应 A Pyp/N PhyM Ap/N或 Up/N CL3 Cp/N, Ap/N和Cp/N B.cereus Cp/N, Up/N T1