【2017年整理】蛋白质分子量的测定.doc

成绩 批改日期南京林业大学 专业 学号 姓名日期 实验四 蛋白质分子量的测定 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法 一、实验原理 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS) ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）。 3.SDS是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。（空间构象破坏） 4.蛋白质与SDS分子按比例(1.4gSDS/g蛋白质)结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷,因而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 5.当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX， 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 二、凝胶的原理 1.聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂 N ， N –亚甲基双丙烯酰胺（Bis 在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 2.双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度 3.常用的催化剂（包括催化剂和加速剂） （1）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二胺）系统 在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 [（NH4）2S2O8 ] 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8)。 （2）核黄素– TEMED 系统 这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。 4.凝胶的浓度： 常用的所谓标准胶是指浓度为 7.5 ％的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用 7.5 ％的标准凝胶或用4％～ 10％的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。 5.SDS电泳系统有两种： （1）连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。 （2）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：由浓缩胶和分离胶组成。 通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应 ，使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 三、 实验试剂： Acr（acrylamide）/Bis 储备液 10% (w/v) SDS ： TEMED(四甲基乙二胺) 过硫酸铵 (AP):10%现配现用 Tris－HCL缓冲系统， 分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8） 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8 电极泳缓冲液：使用的Tris－甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含SDS 样品缓冲液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ） 染色液（考马斯亮蓝 R-250） 脱色液：（ 甲醇：冰醋酸：水=4：1：5） 溴粉兰：0.1% 四、实验步骤： l. 贮液配制： 应注意： （1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 l ～ 2 个月。 （2）过硫酸铵应当天配制。 （3）如有不溶物要过滤。 （4）显色液用前再混和。 （5）电极缓冲液用时稀释 10 倍。 2. 安装夹心式垂直板电泳槽 3.配胶：采用不连续系统 1）分离胶的制备（10ml，12%）： 蒸馏水 3.4ml Acr/Bis储备液 4.0ml 分离胶缓冲液 2.5ml 10%SDS 100μl 10%APS 50μl TEMED 5μl 按上述配方依次加入各种溶液，充分摇匀后灌入制胶架中。 （2）浓缩胶的制备（5ml，5%） 蒸馏水 2.85ml Acr/Bis储备液 0.85ml 浓缩胶缓冲液 1.25ml 10% SDS 50μl 10% APS 25μl TEMED