厌氧微生物菌种保藏技术规程.doc

厌氧微生物菌种保藏技术规程引??? 言 厌氧微生物是一类需要在无分子氧或低氧化还原电势的条件下才能正常生长繁殖的微生物，在自然界中分布广泛，种类繁多。有些厌氧微生物具有临床致病性，有些却能在维持人畜肠道正常的微生态、清洁能源开发、环境治理、石油开采等方面发挥重要的作用，作为一类重要的特殊微生物资源日益引起重视。由于厌氧微生物的生理特殊性，其培养和保藏技术的关键是要使该类微生物处于无氧或氧化还原势低的环境中。对厌氧微生物菌种资源进行长期有效的保藏是这类资源实施有效共享的前提，采用操作简便、保藏周期长、遗传变异率低的保藏方法是首要选择。 制定本规程是为了规范厌氧微生物菌种资源保藏技术操作，加强厌氧微生物资源的安全与质量管理，以达到保护、利用和实现资源共享的目的。 厌氧微生物菌种保藏技术规程 1　范围 本规程规定了厌氧微生物菌种保藏技术基本原则、技术要求、方法及步骤。 本规程适用于各类厌氧微生物菌种的保藏。 2　规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件 微生物菌种常规保藏技术规程（试行） 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1　厌氧微生物 Anaerobes 厌氧微生物是一类需要在无分子氧或低氧化还原电势的条件下才能正常生长繁殖的微生物。 3.2　菌种保藏 culture preservation 是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。 3.3　定期移植保藏法 subculturing 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4－6进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 3.4　冷冻干燥 freeze-drying 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。 3.5　液氮超低温保藏 preservation in liquid nitrogen 液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的液氮气相中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物处在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。 3.6　-80低温冷冻保藏 preservation at -80 将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞生理活动进行冷冻的一种保藏方法。 3.7　液体干燥保藏 liquid-drying 无需将微生物冷冻，直接在常温状态下，通过减压利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态的一种保藏方法，适合于对低温冷冻敏感的厌氧微生物资源的保藏。 4　保藏方法 4.1　定期移植法 参见附录A 4.2　真空冷冻干燥法 参见附录B 4.3　液氮超低温冻结法 参见附录C 4.4　-20～-80低温冷冻保藏法 参见附录D 4.5　液体干燥保藏法 参见附录E 附录1 定期移植法 1　原理 低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变、延长菌种保藏时间的目的。 2　技术要求 2.1.1　不同菌种应根据要求选择合适的培养基。容器应当选择带异丁胶塞的厌氧试管或血清瓶。 2.1.2　接种时应采用亨盖特厌氧技术或在厌氧操作箱内进行，要求做到厌氧、无菌操作。 2.1.3　保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，厌氧试管胶塞有无漏气现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。 2.1.4　大量菌种同时移植时，各菌株的编号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。 2.1.5　每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。 2.1.6　斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。 3　方法与步骤 3.1　培养基制备 3.1.1　血清瓶与厌氧管的准备 清洗血清瓶与厌氧管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，121下高压灭菌15-20分钟，备用。 3.1.2　溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素等材料加入水中溶解，最后加足水量。 3.1.3　调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调节pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 3.1.4　加凝固剂