微生物（细菌）菌种检定技术规程.doc

微生物（细菌）菌种检定技术规程 1 范围 本规程规定了微生物（细菌）菌种的检定方法。 本规程适用于常见细菌菌种的检定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。鼓励和应用本规程使用这些文件的最新版本。 GB/T1.1—2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编号规则》 GB/T1.2—2002《标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确认方法》 《中华人民共和国药典》2010年版二部 无菌检查法 《中华人民共和国药典》2010年版三部 无菌检查法 EN1659体外诊断方法，微生物培养基术语和定义 EN12322 体外诊断方法医疗设备，微生物培养基、培养基性能指标 美国国家临床试验室标准委员会（NCCLS）标准 世界卫生组织（WHO）编《实验室生物安全手册》中文第三版 伯杰细菌鉴定手册（第九版），注意采纳最新版本的可能性 3 术语和定义 本条款规定了与质量控制相关的通用定义以及培养基和质量质控相关的术语。 3．1 质量控制 qualitycontrol 为达到质量要求所采取的操作检定技术和活动 3．2 培养基 cultural medium 液体、半固体、或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质。 3．3 参考菌株 reference strain 鉴定定义到属、种水平的菌株。（有可能到血清型、亚型），按菌株生物学特性进行分类描述，并有明确的菌株的来源。菌种检定时的阳性对照株应为国家或国际标准菌种的模式菌种。 3．4 参考原株 reference stocks 将实验室分离到的转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。 3．5 工作菌株 working culture 参考菌株转接一代后获得的菌株。 3．6 引种 指从中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统（CCCCM）或布达佩斯条约微生物国家保藏单位引进的菌种。 4 要求 4．1 菌落形态 在有氧、兼性厌氧或厌氧条件下，经36°C±1°C（或最适温度）培养18～24h，在固体培养基上生长成细菌集团，各类细菌菌落不尽相同，但是统一原则是，要选择“S”型菌落进行进一步的检定。在适宜培养基，经36°C±1°C培养，18～24h，呈现均匀混浊性生长。 4．2 革兰氏染色 4．2．1 染色液的配方和染色方法依据GB/T4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》进行。 显微镜下观察，菌体呈现紫色者为革兰氏阳性菌，呈现红色者为革兰氏阴性菌。 4．3 氧化酶实验 4．3．1 试验方法与试剂依据GB/T4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》进行。 阳性者，立刻出现红色，10～30min变为紫黑色。阴性者不变色。 4.3.2 过氧化物酶的作用可受氰化钾的抑制；试剂在空气中易氧化（一般在4°C冰箱中保存一周），故应经常更换新配试剂。 4.4 Hugh—leifson 培养基（O/F试验） 4．4．1 培养基的配制和实验方法 按GB/T4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》进行。 4．4．2 结果 反应类型 封口的培养基 开口的培养基 发酵型（F） 产酸 产酸 氧化型（O） 不变 产酸 产碱型（A） 不变 不变 4．5 结果解释 依据4.2、4.3、4.4的结果，指示菌种的检定方向。 5 试验方法 5．1 设备器材 培养箱、干烤箱、压力蒸汽灭菌器、灭菌吸管、灭菌平皿、灭菌试管。 5．2 试验操作总则 5．2．1 所有操作应在符合生物安全规定的微生物实验室和无菌操作间进行。 5．2．2 真空冷冻干燥的菌种最多向下传三代至四代，就应更换菌种。 5．2．3 每次实验应由2个以上的实验人员完成，并在鉴定记录上签字。 5．3 复苏 将复苏后的（按微生物（细菌）菌种制备技术规程5.4进行）菌种划线分离于相应的培养基中，置于培养箱内经36°C±1°C，18～24h后进行菌种鉴定实验。 5．4 菌种检定 5．4．1 菌落形态和革兰氏染色，氧化酶，O/F试验。 5．4．2 挑取“S”型菌落进行革兰氏染色，氧化酶，O/F试验。 5．4．3 挑取“S”型菌落进行系统生物学检定。 依据GB/T4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》； GB17012-1997《感染性腹泻的诊断标准及处理原则》；伯杰细菌鉴定手册（第九版）进行检定。 5．4．4 认真填写菌种检定纪录及检定结果，存档。 6 真空冷冻干燥菌种性能检查 6.1 外观检查 菌种管管壁无黑头；粘贴标签于菌种管上部3/4处；内容表达完整、准确。 6.2 质量检查 对入库菌种管进行抽检。抽检率为5％，存活率达到100％，分离培养无杂菌污染，革兰氏染色、显微镜观察，菌体形态典型。 6.3