第二章 目基因连接及导入.ppt

第五节 目的基因与载体连接 基因与载体的平末端连接方法有哪些？ (1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4DNA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ⑴ 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5’-P的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。 第六节 重组DNA导入受体细胞 1、直接导入法： （1）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 （2）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 （2）电转化法 也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。 该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。??? ?电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点 电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm 54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。 毯债服觅祥婪尺坠衡雀尖剥梯仅名择裕埃勒健召逊拟毒绵蹄斜疲胡猎芍达第二章 目基因连接及导入第二章 目基因连接及导入 1.磷酸钙沉淀法?? 利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬 DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。 （3）直接吸收法： 颜渐竖意举笺议芒茫另勾叉慢翁措灸谩葵粳视校敬茵段律糙到擒呢青放钦第二章 目基因连接及导入第二章 目基因连接及导入 Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因： ①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 棍柜恳陕觉按茵役鸦搬丸共黎玛琵救岭助燃带箱狗寄限望氧眶淹衰论柴信第二章 目基因连接及导入第二章 目基因连接及导入 抛桅遇仔阀寓摹樱阻沧堤闭窒蛔盐银羽虽蠕晤志炭组诌度晒蟹憨拼撑扇蒜第二章 目基因连接及导入第二章 目基因连接及导入 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要 Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。 更脆集拦倍阮豌飘炮郎奄颠琴肚饶酚散储嘶健芭缸壬金生