【2017年整理】细胞培养基本知识基本技术.ppt

细胞培养的基本知识、 基本技术 ;主要内容：;一、 细胞培养;培养细胞的特性1 -生长方式及类型;培养细胞的特性2 - 增殖特点;贴附-伸展;接触抑制;细胞增殖密度抑制;培养细胞的特性3 -生长过程;高等生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h ;一群细胞的增殖：细胞生长曲线; 潜伏期/滞留期 指数增长期 平台期/停滞期 退化或死亡 ;细胞系的生长过程 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;有限细胞系（Finite cell line）如果不能继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。 连续细胞系（Continuous cell line）能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系。可培养50代以上并无限培养下去。 大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大多已发生变异。 ;原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代前。 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。 ;培养瓶培养法;培养板培养法;悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术;1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题 盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法 ;悬滴培养法基本步骤;1910 至 1923年 – Carrel 和早期的组织培养 卡氏瓶培养法 ;1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。 从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。;无血清培养;三维细胞培养技术?;普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。 应用： 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）;目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集 ;细胞培养技术的特点及应用;应用;二、培养细胞生长环境;1 、细胞的营养需求;基础培养基的选择;血清;血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清： 胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准： 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 ;pH 调整液;抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。 最终使用浓度为每毫升100单位。 ;制备1000ml RPMI?1640培养基;消化液;胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 ;胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液（常用浓度为0.25% ）搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效）， 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调 pH 至7.2 左右;EDTA·4Na 溶液;D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS);2、 生存环境;温度;气相和PH;3、无毒无污染;;Cell Culture Basic