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实验四 微生物的分离与平板菌落计数法 【实验目的】 ①了解利用平板菌落计数法测定微生物样品 中活细胞原理。 ②掌握掌握平板菌落计数的操作步骤与方法。 【实验原理】 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀 释之后，取一定量的稀释样品液接种到 平板上，经培养后，每个单细胞繁殖形 成肉眼可见的菌落，选择每板上菌落数 在30～300之间的平板统计菌落数，用平 板上(内)出现的菌落数乘上菌液的稀释 度，即可计算出原菌液的含菌数。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需 要培养一段时间才能取得，而且测定结 果易受多种因素的影响。 但是，由于该计数方法的最大优点是可 以获得活菌的信息，所以被广泛用于生 物制品检验，以及食品、饮料和水等的 含菌指数或污染程度的检测。 【材料和器皿】 ①菌种：培养8h的大肠杆菌。 ②培养基 ：LB培养基。 ③器皿：无菌试管，无菌移液管，无菌平 皿等。 ④其他：无菌生理盐水，试管架，记号笔。 【方法和步骤】 ①融化培养基 先将LB固体培养基加热融化，置于50度水浴 锅中备用。 ②倒培养液 将固体培养基融化并冷却至45℃左右倒入加 好样品的平皿中，每平皿约倒入10～12ml培 养基，随即快速而轻巧地晃动培养皿，注意 不要使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 ③编号 8支试管依次编号为10-1，……10-8,再取 平板，依次编号为10-6,10-7,10-8，各 稀释浓度3个重复。 ④分装稀释液 以无菌操作法用5ml移液管分别吸取4.5ml无 菌水，与上述编号的试管中。 ⑤稀释菌液 用1ml无菌吸管吸取0.5ml已充分混匀的待测 菌液，转入10－1的试管中，此即为10倍稀 释。另取一支1ml洁净无菌吸管插入10－1试 管中，来回吹吸菌悬液数次，将菌体分散均 匀。用此吸管吸取10－1菌液0.5 ml移至10－ 2试管中，此即为100倍稀释。……其余以此 类推，整个过程如图所示。 平板菌落计数法的稀释流程示意图 ⑥转移菌液 用一支1ml无菌吸管吸取10-6,10-7,10-8的稀 释菌悬液各0.2ml，向已编好号的无菌平皿。 用涂布器涂匀。 ⑦倒置培养 待平板完全凝固后，倒置于37℃恒温箱中培 养。 ⑧计菌落数 培养24、48h、72后，取出平板，算出同一稀 释度三个平板上的菌落平均数，在平板菌落计 数中，可用彩色笔或钢笔在皿底点涂菌落进行 计数，以防漏计和重复。实际工作中同一稀释 度重复对照平板不能少于三个，且同一稀释 度的三个重复对照的菌落数不应相差很大， 否则说明试验误差太大。 由10－6、10－7、10－8三个稀释度计算出的每ml菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，培养后所出现的平均菌落数小于100个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。 【结果记录】 下面的表格是对一个培养时间菌液的平板计 数结果的记录表格，其余培养时间菌液的计 数表格请依此自行制作，将菌落计数结果填 入表格： 【注意事项】 吸入菌液时移液管要伸入管底，吹出时 一定要离开液面，以免使试管内液体外 溢。 菌液移至下一稀释度试管时注意勿使移液管 尖段触到液面，即每一支移液管只能接触一 个稀释度的菌悬液，以尽量减少误差。 【实验报告】 1、平板菌落技术的原理。 2、要获得本实验的成功，那几步最为关键，为什么？ 3、本实验结果记录与分析。 * 72 48 24 10－6 （－7 or－8） X3 X2 X1 活菌数/ml菌液（个） 每稀释度平均数（个） 每皿菌落数（个） 培养 时间 （h） 稀释 度 X1＋X2+X3 3 活菌数(个) /ml菌液＝ ×稀释倍数×5 ×100 *