PCR相关技术在微生物鉴定中的应用.docx

PCR相关技术在微生物鉴定中的应用于侦云 2011102023（植物保护学院植物病理学系）摘要：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，是一种体外酶促反应,用来扩增特定DNA片段的方法。该技术具有特异性高，灵敏度高以及检测速度快等优点，广泛地应用在各领域的微生物检测的。这一技术的运用，开辟了微生物分类鉴定的新途径。本文介绍了几种基于PCR技术的鉴定方法，以及其在微生物检测中的应用情况。关键字：PCR；微生物鉴定Application of PCR-related technology in the microbial identificationYuzhenyun 2011102023（Department of Plant Pathology , College of Plant Protection）Abstract：PCR(polymerase chain reaction,PCR),is amethod used to amplify specificDNAfragmentsin vitro enzymatic reaction.The technology has an advantage of high specificity, high sensitivity and detection speed,etc.,which is widely used in various fields of microbial detection. The use of this technology opens up new ways to microbial classification and identification. This article describes several methods of identification based on PCR technology and its application in microbiological testing.Keyword: PCR；Micro-organisms identification传统的微生物鉴定方法主要基于其表型、生理生化特征，如显微镜观察微生物形态、微生物计数、微生物染色等。但随着生产生活应用，从型、亚型、株、甚至分子水平上去认识微生物变得愈来愈重要。传统的微生物鉴定技术在实际应用中存在一定缺陷，已不能满足人们的认知需要。随着分子生物学的迅速发展，微生物的分类鉴定进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、ITS序列和16S rDNA序列分析等。PCR技术于1985年由美国的Karray等首创并由美国Cetus公司开发得到。常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液和MgCl2溶液的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，一对寡核苷酸引物特异性结合的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等3步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。它具有快速、简便、分辨率高的特点，并可进行多相分类鉴定。PCR技术与其他分子技术想结合，使细菌、真菌、病毒等微生物分类鉴定方法更客观合理。到目前为止，PCR技术已在食品，医药卫生，畜牧业，农业以及海洋生态等微生物检测中广泛应用。1基于PCR 的分子生物学方法所1.1多重PCR技术(Multiplex PCR)多重PCR (multiplex PCR)原理与常规PCR相同,只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性引物，若与各引物对特异性互补的模板存在,则可同时在同一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段。Cortez等[1]用多重PCR检测了家鸡屠宰场不同来源样品中的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和其他血清型的沙门氏菌。其使用了3对引物,分别来自沙门氏菌的invA,pefA和sefA基因。在检测的288份样品中,鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率为62%,其他血清型的沙门氏菌为10%。多重PCR技术有以下特点：①在多重PCR测定中密切相关的模板是由于扩增不同序列而分开的，所有模板共有序列的引物可为扩增提供阳性对照。②比单位点PCR更有效地确定模板质量，其指数扩增和内部标准可用于评价细菌样品中某一特定菌种的含量。③消耗试剂少，准备时间短，对保持昂贵的聚合酶和模板的低消耗水平是很理想的。但多重PCR技术扩增条件严格，需要优化PCR反应条件，以达到最佳扩增效果，降低扩增的错误率。利用这一方法可以同时检测多个目的基因或借助其交叉限制进行确认。但多重PCR技术也存在较明显的不足，如扩增效率不高，敏感性偏低；扩增条件需要摸索与协调；可能出现引物间干扰等。1.2随机扩增多态DNA（Random ampli