蛋白质杂交题稿.ppt

Western blot 实验技术;定义：;Western Blot基本原理;Western Blot一般流程;;;通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 ;2.低温有机溶剂提取法 蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。 3.水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。 4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白 ;重组蛋白的特点： 目的蛋白质的量较多，至少点总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。 可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。;重组蛋白的特点： 包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。 分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。;蛋白样品的定量;蛋白样品的定量;蛋白样品的定量;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis） ?? 聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及Bis的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔径越小。 TEMED 过硫酸铵（APS）(时间) TEMED 及APS激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁醇隔绝空气的条件下反应。 SDS 配胶的Tris缓冲液 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 ;凝胶浓度与蛋白分离范围;浓缩胶浓缩蛋白质的原理;电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 **预染蛋白质分子量标准包含了从19kD到117kD共6种纯化的预染蓝色蛋白质，可以直接使用，无需煮沸。每次上样5-10微升，就可以在电泳时、电泳后或转膜后观察到非常清楚的蛋白条带。;1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥，电压越小，条带越漂亮。 ;转膜;转膜 ;转膜后检测;封闭;封闭液选择;一抗、二抗孵育;回收一抗溶液？;一抗选择;二抗算不算多余？一抗不能显色吗？ ;二抗与底物反应显色;DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。 DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。;成功的例子;杂交结果的分析;免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。 免疫组化定量分析（半定量）：用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为0～3 分,着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用软件进行处理，如image?pro?plus?5.0（IPP5）。 ;Western Blot常见问题分析;不恰当的样品制备会导致