第二章 预处理(2012.2).ppt

第二章 生物样品的预处理 生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，因此对目标组分进行初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作都属于预处理。 种类： 植物或动物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织提取液等。 特征： ⑴ 目标产物浓度较低，悬浮液大部分是“水”，组 分复杂，是含多种物质的混合物； ⑵ 分离过程易失活，pH、离子强度、温度等变化常常 造成产物的失活； ⑶ 性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生 物污染，蛋白水解作用等。 1.植物组织 植物组织被破坏时，一些目的物和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和目的物反应, 使目的物失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应往往是必须进行的步骤。 植物组织预处理需注意： ⑴ 温度尽可能低； ⑵ 提取液的量要保证“充分浸入”； ⑶ 加入足量酚类吸附剂； ⑷ 加入足量氧化酶抑制剂； ⑸ 搅拌转速要恰当； ⑹ pH要控制在合适范围，一般5.5～7.0 。 酚类吸附剂的种类： 天然和合成的聚合物：如清蛋白、尼龙粉、聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP） 聚苯乙烯和聚丙烯树脂：如基于聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。 氧化酶抑制剂的种类 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，而抗坏血酸盐则较少使用。 前三种既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除剂； 抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（50mmol/L）。 2. 动物组织预处理 匀浆化前的预处理 (冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等 ) 提取液的澄清 ( 高速离心、沉淀、吸附等) 3. 微生物物质的提取制备 大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。 对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相； 对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。 3.1 微生物发酵液预处理 主要包括 1）发酵液杂质的去除 2）改善培养液的处理性能 发酵液杂质的去除 发酵成分复杂，对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白 主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等…… 无机离子的去除 钙离子: 加入草酸(形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还 能促使蛋白质凝固 镁离子: 加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可 不再干扰离子交换 铁离子: 加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀 可溶性蛋白质的去除： 1）盐析 2）等电点沉淀 3）加热法 4）有机溶剂沉淀法 5）吸附法 6）其它沉淀法 有色物质的去除 常用脱色方法为吸附法 如活性炭吸附、树脂吸附等 发酵液处理性能的改善 降低发酵液的黏度 加热法和加水稀释法 调节pH值 因pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可以改善过滤特性。 细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，往往不能直接过滤，直接用离心法实现，则能耗很大，应用微滤的方法，又容易产生膜堵塞。此时可选择采用细胞絮凝技术。 细胞絮凝技术 指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。 通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内,如胶体的颗粒表面吸附大量的高分 子物质,反而会在表面形成空间保护层。 絮凝剂分类 习惯分为： 无机絮凝剂、有机絮凝剂 无机絮凝剂： 无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、 硫酸亚铁、氯化铝等)；无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合铝铁等) 有机絮凝剂： 天然高分子 絮凝剂(如淀粉的改性产物)； 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺) 无机与有机复合絮凝剂往往效果更好； 微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多糖、多聚氨基酸蛋白质或糖蛋白为主，还有少量的DNA和脂类絮凝剂；