第二章生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离.解读.ppt

第二章　生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离 概 述 发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固态培养基等固态悬浮颗粒与可溶性组分分离，即固液分离。 如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。 如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。 如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。 第一节　确定预处理方法的基本条件 一、了解生物活性物质存在的部位 胞外：细胞产生后，分泌到培养液中 胞内：游离在胞浆中、结合在质膜上等 二、稳定性 分离提取时，生物活性物质处于不断变化之中，可被细胞本身的酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备时受到pH值、酸、碱、温度、金属离子、盐、机械搅拌等的作用。 如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在4.8～5.2，并且低温。 多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95℃处理，可提高过滤速度。 三、提取工艺对滤液质量的要求 不同工艺路线对滤液要求不同 离子交换法：无机离子、灰分要求低 溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化 直接沉淀法：对滤液质量要求高，需反复过滤，结晶前还要脱色处理。如四环类抗生素。 第二节　生物材料的预处理 预处理的目的 （1）改变发酵液的物理性质，以利于固液分离。 　主要方法：加热、凝聚和絮凝。 （2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质和无机盐等），以利于后续各步操作。 　可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如堵塞层析柱头）。 一、菌丝体和蛋白质的处理 （一）等电点沉淀 等电点时蛋白质溶解度最小（调pH） （二）变性沉淀 变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀 加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快过滤速度 链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。 柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。 （三）加各种沉淀剂沉淀 　某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀。 　酸性溶液中：蛋白质能与阴离子成盐形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐等。 　碱性溶液中：蛋白质能与阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等。 （四）加入凝聚剂（小分子） 可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。 凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 胶体稳定的因素：电荷、水化层 电解质能中和电荷、破坏水化层 与蛋白质盐析的机理相同。 发酵液的带电现象 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。 但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。 （五）加入絮凝剂（高分子） 絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。 吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于过滤。 可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。 影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水中溶解度也降低。 （2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低絮凝效果。 （3）PH值：影响电离度，从而影响链的伸展形态。 （4）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快会打碎絮凝团。 常用的絮凝剂 　凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性， 　增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。 （六）吸附 　加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。 　如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除去。 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。 　（七）酶解法去除不溶性多糖 　 不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离困难，可加入淀粉酶进行水解，将发酵液中多余淀粉水解。 二、高价金属离子的去除 对提取和成品质量影响较大。