第四章 单克隆抗体和抗体工程幻灯片.ppt

五、抗体酶 抗体酶(abzyme)：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。 抗体酶的制备(自学) Immunotoxins Protein toxin connected to Fv region Single-chain or S-S linked Fv region Toxin localized to antigen-expressing cells 六、单链抗体(single chain antibody) 单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。 单链抗体 Fv片段抗体(single chain Fv fragment,scFv) 要获得正确的抗原结合构象,VL—衔接物—VH; 单链抗体的应用前景 体积小,免疫原性较低,不易引起人体的免疫排斥,渗透性好,能有效地穿透致密的肿瘤屏障,有利于基因治疗。 构建双功能分子—生物导弹 单链抗体的应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。 研究基因结构与功能的关系 七、嵌合抗体 (chimeric antibody) 嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 八、双价抗体与双特异性抗体 (bispecific antibody) 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。 九、单克隆抗体的改造和应用 单克隆抗体与杀伤性药物耦联—破坏特定的目标细胞; 单克隆抗体与药物前体耦联—在酶的作用下,可转化为具杀伤活性的药物,杀伤靶细胞 转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全的人源单克隆抗体 轻链和重链各由位于两条染色体上的两组基因分别编码。 通过重排产生大量的各不相同的轻链和重链分子。 再通过轻链和重链分子之间的排列组合而形成几乎无限的多的抗体分子。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 93 94 95 28 29 30 1 2 3 4 5 6 μ δ ν ε α VH DH JH CH VH(1/95) DH(1/30) JH(1/6) CH(1/5) 基因重排后得到的重链 A 74 75 76 1 2 3 4 5 VK Jk 1 2 3 4 5 Ck Ck Vk(1/76) Jk(1/5) Ck B 基因重排后得到的轻链 ES细胞 人重链基因 YAC 人轻链基因 YAC H κ 抗体基因敲除的小鼠 抗体基因敲除的小鼠 × × hH hκ × 只表达人重链的纯合转基因鼠 只表达人轻链的纯合转基因鼠 hAb 只表达人源抗体的纯合转基因鼠 第四节 基因工程抗体和抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获得目的基因 2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。 3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。 四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。 二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库 抗体文库?1011库容，能包含B细胞全部克隆。 建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。 VH和VL随机重组增加抗体的多样性。 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体， 因此产生的抗体必然都是高亲和力的。 三、基因工程抗体的表达 1、原核细胞表达 2、真核细胞表达 3、转基因植物表达 4、转基因动物表达 第五节 抗体诊断试剂 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 1、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备步骤： （1）制备细菌抗原，O（菌体）抗原，H（鞭毛）抗原； （2）免疫动物和制备抗体血清 2、乙型肝炎病毒表面抗原（HB