【2017年整理】03-蛋白质-6.ppt

;一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯的一般原则 五、蛋白质混合物的分离方法 六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定;蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。 ;蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、 粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具有丁达尔现象。 ?蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。;?使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：;2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。 有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。;4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。;?;4.蛋白质变性后的表现： 1）生物学活性消失2）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增 加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。 ;电 泳;1、粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ② 等电点选择性沉淀法 ③ 有机溶剂分级沉淀法 ④ 热处理选择性沉淀法 ⑤ 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法;2、细分级（fine fractionation) ①透析除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC） 电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳 密度梯度离心;根据分子大小 根据蛋白质的溶解度 根据电荷差异 选择性吸附分离（物理吸附） 根据配体特性异性分离（亲和层析） ;测分子量的方法： 化学组成法测定最低分子量 SDS法 凝胶过滤法 渗透压法 扩散系数法 沉降系数法和沉降平衡法;1. 根据分子组成测定最小分子量 p291 如肌红蛋白含0.335%的铁 Fe分子量 55.8 最小M＝ Fe(%) = 0.335 =16700 (实为16900马心) 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp; 2、 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 p297-298;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;柱床体积 Vt=Vo+Vi 洗脱体积 Ve=Vo+kd·Vi ;①当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo出来， 无分配。 ②当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。 ③当0〈kd〈1时，Ve=Vo+kd·Vi,各溶质具不同分配，得以分离;p298;交联葡聚糖（Sephadex）;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;3 .据pr的渗透压 p292;半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。;4.SDS—PAGE p298 （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳）;极性头部;沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心