质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验报告.doc

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03 小四号，宋体，1.5倍行距数字、英文用Times New Roman；实验目的PCR基因扩增的原理和操作方法 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法 3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法 4、 了解质粒酶切鉴定原理 5、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小 实验原理 35~70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 （3）延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2、质粒DNA的提取： （1）碱裂解法： 1）基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： 2）高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； 3）当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 （2）离心层析柱： 1）硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； 2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： 1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性。 2）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3）A260/A280比值可以反应DNA的纯度。 4、质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 5、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法以流程图示意 DNA的提取 3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法） 4、质粒DNA的酶切鉴定 5、琼脂糖凝胶电泳 四、结果与讨论①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。 Geldview有毒，切勿用手接触。 4、思考题: （1）碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？ 答：溶液I：含有溶菌酶，葡萄糖和EDTA。溶菌酶具有溶菌的作用。葡萄糖可以增加溶液的黏度，维持渗透压，以保护DNA，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA可以螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，加强溶菌酶的溶菌效果。 溶液II：含有NaOH和SDS。NaOH提供高碱环境，使DNA变性。SDS能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，解聚细胞中的核蛋白，与蛋白质结合为复合物使蛋白质沉淀下来。 溶液III：起缓冲液的作用，调节pH至中性使质粒DNA复性。溶液还提供了高盐环境，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀下来，从而被除去。 （2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 答：1）酶的选择：尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。 2）酶量的选择：任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20μl。 3）底物DNA的纯度：严格实验操作步骤，尽量纯化底物，提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发干净。因为主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应。 4）反应系统：构建酶切反应体系时，应该先加入缓冲液再加入限制酶，最后加入质粒DNA。因为反应缓冲液中合适离子强度可以激发酶切反应，提高反应效率。 5）反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%。 6）保温时间与温度：保温时间和温度应准确，温度的改变会使酶识别错误。 取0.2 ml PCR反应管一只 用微量加样枪加入灭菌去离子水6.0μl ?6?l ?12?l 将反应管放到PCR仪上进行扩增 加入2*Premix Taq 12.0μl 加入引物1-SO100 (10