质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定.ppt

2、离心层析柱 PCR相关技术 PCR相关技术 荧光定量PCR（real-time PCR） PCR相关技术 2、离心层析柱 四．质粒定量检测 紫外分光光度计法 酶切鉴定DNA restriction enzyme digestion 注意事项 50/RAR/ PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。  * * * 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 9000rpm×30 s，弃上清 加入250μl 溶液P1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 加入250μl 溶液P2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮（溶液P2为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 加入400μl 溶液P3，立即温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，室温放置3-5min。（溶液P3为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时使SDS-蛋白复合物沉淀），室温13000rpm离心10min，小心取上清液。 将吸附柱放于收集管中，加入500μl去蛋白液，室温13000rpm离心1min，弃滤液，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。 向吸附柱中加入500μl 漂洗液WB， 13000rpm离心1min ，弃滤液。 重复步骤6一次。 空柱13000rpm离心2min，室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl无菌水，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用。 * * * * 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 * 酶活力:单位U:1小时完全消化1μL DNA的酶量为1个单位 * * * 基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 * * * 载体的标准：（1）能自主复制；（2）具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；（4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 * * * * * 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 9000rpm×30 s，弃上清 加入250μl 溶液P1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 加入250μl 溶液P2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮（溶液P2为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 加入400μl 溶液P3，立即温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，室温放置3-5min。（溶液P3为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时使SDS-蛋白复合物沉淀），室温13000rpm离心10min，小心取上清液。 将吸附柱放于收集管中，加入500μl去蛋白液，室温13000rpm离心1min，弃滤液，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。 向吸附柱中加入500μl 漂洗液WB， 13000rpm离心1min ，弃滤液。 重复步骤6一次。 空柱13000rpm离心2min，室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl无菌水，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用。 * * * 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。 * * * I:结合于识别位点上并随机切割识别位点不远处的DNA III.识别位点上切割DNA，然后从底物上解离。 * * 影响酶切反应的因素 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇、EDTA、SD