Western-blot实验方法步骤试题.ppt

免疫沉淀法检测表达蛋白 可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物中的靶抗原。 很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白。 当与SDS并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。 操作步骤 靶蛋白的放射性标记 裂解细胞 特异性免疫复合物的形成 免疫复合物的收集和纯化 放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析 靶蛋白的放射性标记 同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素是以35S－标记蛋氨酸或35S－蛋氨酸和半胱氨酸。 这些氨基酸是哺乳动物细胞的必须氨基酸，必须由培养基中提供。 培养基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培养基中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。 同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度和其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。 免疫复合物的收集和纯化 用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进行吸附：结果清晰，但成本高，并且所需抗体有种系特异性的限制。 用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进行吸附：背景高，但是经济。 用抗被检蛋白抗体的抗体进行吸附，这种方法用于下列两种情况：1第一抗体的FC不能被葡萄球菌蛋白质A识别；2对被检蛋白进行定量分析时。 Western-blot 试验 概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。 溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。 溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。 细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf -80°C保存 注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。 主要试剂 RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司） 仪器与设备 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司） 配制试剂 10×电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml SDS