western blot实验步骤分析和总结.docx
W e s t e r n b o l t
一、实验目的
通过实验了解westernblot技术的原理和操作。
二、实验原理
SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Westernblot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材
电泳槽，胶板架子
转膜仪
NC膜
电泳电源
滤纸
摇床
X射线摄影暗匣
X射线胶片
塑料薄膜
四、实验试剂
1.runningbuffer
5xrunningbuffer(1L)Tris 15.1g
Glycine 94.0g
SDS 5.0g
ddH2O 定容至1L使用前稀释5倍
2.Transferbuffer10×Transferbuffer(1L)Tris 30.3g
Glycine 144.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇3.TBS
10×TBS(500mL)
Tris 12.1g
Nacl 40.0g
ddH2O 定容至500mL用HCl调节溶液的pH值至7.64.TBST(1L)
1×TBS:Tween-20=1000:1
ddH2O定容至1L
5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)
脱脂奶粉 2.5g
TBST 定容至50ml
一抗溶液
二抗溶液
显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。
SDS（配方见下一页）
五、操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS胶的配置
①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。
②准备好试剂。
③计算所需要使用试剂的量。
例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要7ml，10块胶，共需要70ml
④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有正反之分，上面的“up”朝上。
⑤准备配胶按照上面配方依次添加。注意：1.添加量少的试剂要注意混匀2.TEMED，APS要最后加
⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。
⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。
⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。
⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约3ml。注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。
A.分离胶
6%GEL
5ml
7ml
8ml
10ml
H2O
2.85
3.99
4.56
5.7
40%Acr/bis
0.75
1.05
1.2
1.5
1.5Mtris-HCl
（pH8.8）
1.3
1.82
2.08
2.6
10%SDS
0.05
0.07
0.08
0.1
10%AP（过硫酸铵）
0.05
0.07
0.08
0.1
TEMED
0.004
0.0056
0.0064
0.008
8%GEL
5ml
7ml
8ml
1