第3章_基因克隆载体.ppt

第三章 基因克隆载体;基因克隆载体的特点;２ 克隆载体的分类;质粒和噬菌体DNA兼有的载体 　Phasmid 载体（含有f1 噬菌体的ori） 　 Cosmid 载体（含有λDNA的Cos区） 染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 　 基因整合平台系统 　ＹＡＣ克隆载体 其它克隆载体;2.2 按克隆载体的用途分类;第二节 质粒克隆载体;6）相关基因 ;２ 几种常见的质粒载体;2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组装了MCS． ;pUC 18-19多克隆位点;3）pBluescript M13： 含有M13噬菌体DNA复制起点的载　 体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动　 子的一个来自pUC质粒的载体当中． ;pBluescript M13多克隆位点;4）Ti质粒载体;;病毒区基因及功能;Ti质粒T-DNA的边界序列;３ 质粒载体的构建;3.2 pBR322质粒载体的构建;３.3 pUC18-19 质粒载体的构建;pUC18-19的构建;3.４ 蓝藻质粒载体的构建 ;蓝藻质粒载体pAQE17的构建;3.５ 农杆菌Ti质粒载体的构建; 外源片段共整合到Ti质粒上的过程;双向载体：由两个以上的质粒构建而成. 将Ti　质粒的Vir与广宿主范围质粒的携带目的基因　(MCS)、选择性标记、转移和复制功能整合在　一起.双向载体可在大肠杆菌和农杆菌中进行　复制并稳定存在下去．;第三节 噬菌体衍生的克隆载体;λ噬菌体的电子显微镜照片; a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’ b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的 75-105%( 38-54 kb)．;1.2 λ基因组DNA的结构;?噬菌体的组装;1.3 λ噬菌体载体构建的策略;常用的λ噬菌体衍生载体;2. Cosmid克隆载体;2.2 部分Cosmid载体;3. M13衍生的克隆载体;3.2 M13 DNA的复制与M13噬菌体的增殖;3.3 M13 衍生的克隆载体;第四节 植物病毒载体;1）CaMV-DNA的一般特性;花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构;　CaMV DNA分子上有八个开放阅读框（ORF)和三个间隔区． ORF I：编码运动蛋白，负责CaMV在细胞间运转． ORF II：表达产物与蚜虫口针或前肠的特殊位点 相结合，参与蚜虫的感染． ORF III：编码病毒结构蛋白． ORF IV：编码反转录酶．;病毒增殖;3)CaMV DNA的间隔区;CaMV 35S启动子序列;4）CaMV-DNA限制性内切酶识别位点;CaMV（Cabb B-S）DNA的部分酶切位点;5）CaMV-DNA的存在状态与感染能力;6）CaMV的转录复制与CaMV的增殖;7)CaMV-DNA克隆载体的构建;互补载体系统; 混合载体系统;2. 烟草花叶病毒（TMV)克隆载体;TMV 的 结 构 特 征;TMV克隆载体构建的策略; 第五节 动物病毒基因克隆载体;1)SV40 DNA的一般特性 SV40 DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome） SV40 DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录;SV40基因转录图;SV40 DNA单识别位点限制性内切酶位点;2） SV40-DNA的转录、复制与增殖;3） SV40 DNA衍生的克隆载体的构建;SV 40 DNA晚期转录区取代型载体;SVGT5-R?G--- SV40病毒晚期区段取代载体;重组病毒质粒载体;2. 腺病毒克隆载体;腺病毒结构 ;腺病毒DNA的结构;腺病毒克隆载体的构建;第五节 反转录病毒衍生的克隆载体;1.劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV);RSV病毒RNA分子结构;2???RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译;3)反转录病毒克隆载体构建策略;第六节 基因定位整合克隆载体;外源DNA整合