第3章植物基因克隆的载体.ppt

第三章 基因克隆载体Vectors 二、载体的功能 1、 运送外源基因高效转入受体细胞； 2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 三、发展概况 1.??第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.??第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。 70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。 命名举例 pBR322是最早构建的质粒之一 “p”表明它是一个质粒 “BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez “322”区别于该实验室构建的其他质粒，如pBR325、pBR327等 三、质粒的基本特性 3、质粒的存在形式 体外理化因子作用下可形成下列形式 开环DNA分子(oc-DNA) 线性DNA分子(l-DNA) 超螺旋DNA分子(scDNA) （1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居” 在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。 五、质粒载体的构建 （一）为什么要进行质粒载体的构建？ （1） pSC101，第一个用于基因克隆的天然质粒，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。 （2） ColE1质粒——筛选标志不理想 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞……. （二）构建质粒克隆载体的基本策略 1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。 2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。 （三）质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。 四、常见的人工构建的质粒载体 pBR322是F. Bolivar和R.L. Rodriguez于 20世纪70年代后期构建出来的，也是第一个经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。 pBR322的结构 pUC18/19的结构 复制起点：来自pBR322质粒。 Ampr基因：来自pBR322质粒 lacZ的启动子：来自大肠杆菌 lacZ’基因 ：大肠杆菌lacZ的?-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断 多克隆位点：10个连续的单酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。 pUC18/19的结构 pUC18/19质粒载体的优点 ① 更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。 ② 选择方便：X-gal显色、抗菌素双重直接选择。 ③ 克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 ④ 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。 选择原理 Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。 蓝白斑筛选 X-gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactoside） 是?-半乳糖苷酶的作用底物 ?-半乳糖苷酶作用于X-gal显色反应 ?-半乳糖苷酶能把无色的化合物X