植物克隆载体.ppt

第六节植物克隆载体Ti质粒载体根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)与Ti质粒G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体培养ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用.这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。1)Ti质粒类型（由Ti质粒所产生的冠瘿碱种类而定）i.鱆鱼碱类(octopine)ii.胭脂碱类(nopaline)iii.农碱类(agropine)2)Ti质粒的结构i.环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区i)致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素ii)冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成iii)冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解iv)Ti质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移v)毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体vi)DNA复制区：参与Ti质粒DNA复制Ti质粒的结构ii.T-DNAT-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。不同Ti质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中胭脂碱Ti质粒的T-DNA长23bp,结构连续，具13个基因鱆鱼碱Ti质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为TL和TR,TLDNA长13.2kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因,TR–DNA长7.9kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。123456Ti质粒的T-DNA的同源性2.Ti质粒载体1)Ti质粒作为载体的问题???????i)太大，无适合克隆位点???????ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株2)载体类型i)中间载体(intermediatevector)由以下几部分组成：?适合于E.coli和A.tumefaciens自主复制和选择用标记基因?适合于植物细胞选择用标记基因?一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组）?1-2个来自T-DNA的25bp重复序列?用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）重组DNA的转移过程：中间载体或重组子E.coli(中宿主)A.tumefaciens?在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用感染植物受伤组织或与植物细胞共培养T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中外源基因表达转化接合转移根癌农杆菌中Ti质粒的转移Ti载体的共整合作用Ti质粒衍生的植物克隆载体非致瘤载体的重组ii)非致瘤Ti质粒载体(disarmedTiplasmid)该类载体实际上是辅助载体，其特点是用pBR322DNA取代了Ti质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以与含有pBR322序列的DNA发生同源重组，构成一个完整的重组DNA序列，然后转移至植物细胞。如果在中间载体中插入一个T-DNA的25bp重复序列，在非致瘤Ti质粒载体中插入另一个25bp重复序列，经重组后形成一个完整的T-DNA，这种系统称之为分离末端载体系统(SEV,SplitEndVector)。12345该类载体的显著特点是含有两个T-DNA末端，所有需要转移到植物细胞中去的序列都位于其间。iii)双末端载体(binaryvector)分离末端载体的共整合作用(SEV)转化接合转移生化标记基因：冠瘿碱合成酶基因（NOS，OCS）lacZ,CAT,荧光酶基因，GUS药物抗性标记基因：除草剂耐受性基因，CHMTⅡ（金属巯蛋白基因），Bleomycin，Hgyr，SPT,DHFR,NPTⅡ(Kanr,G418r)标记基因常用的启动子有CaMV35S,OCS,NOS等。3）标记基因例子:pBIN19的结构T-DNA的转移必须依赖于辅助质粒，pAL4404就是一个T-DNA全部丢失的天然缺失突变体。转移过程：