生物化学实验二纸层析法分离氨基酸.doc

实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。 二、实验原理 ⑴ 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验器材 大烧杯（5000mL）：1只/组 毛细管。 喷雾器：公用。 培养皿：1只/组。 层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。 直尺、铅笔：自备。 电吹风：1只/组。 托盘、针、白线：1套/组。 手套：1双/组。 塑料薄膜：公用。 小烧杯：50mL，1只/组。 实验试剂 （1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。 （2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。 （3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 五、实验操作 检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。 （1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。 （2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。 （3）点样：用毛细管浸液取样，点在这四个位置上。同一位置上需点2～3次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。 （4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧 ，边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当上升到12～15cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。 （5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见右图。 （6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。 （7）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。 计算 ： Rf= 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 六、注意事项 ⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 ⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。 ⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 ⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。 ⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。 生命学院 生物化学实验 1