细胞培养实验计划.docx

细胞培养实验计划【实验目的】：首先练习传代培养SACC细胞，之后原代培养大鼠唾液腺细胞。通过体内实验以检测在基因水平苯肾上腺素对放射后大鼠唾液腺细胞nampt蛋白表达的影响。【实验设备】：无菌操作室(包括更衣间，缓冲间和操作间）准备室的设备：三蒸水器，酸缸，烘箱，高压锅，储品柜（放置未消毒物品），储品规（放置消毒过的物品），包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品），PH计（测量培养用液PH值），磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液），滤器及泵。培养室的设备：液氮罐，储品柜（存放杂物），日光灯和紫外灯，空气净化器系统，低温冰箱（-80℃），空调，二氧化碳缸瓶，边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞），超净工作台，倒置显微镜，CO2孵箱（孵育培养物），水浴锅，4℃冰箱（放置serum和培养用液）。【实验物品】：培养瓶50ml，培养皿，96孔培养板，蓝盖储液瓶，20ml试管，试管架，试管刷，手术铺巾，纱布，牛皮纸，滤膜，移液管，红色橡皮塞，离心管，量筒，烧杯，漏斗，细胞计数板，酒精灯，记号笔，冻存管，三角烧瓶，无菌眼科剪，手术器械，头针，注射器，无菌白大褂，鞋架，拖鞋，耐酸手套。【实验试剂】：DMEM（高糖）培养液，DMSO，PBS（自己调配），胰酶，胎牛血清，双抗（青霉素，链霉素），胶原酶，碳酸氢钠，重铬酸钾，浓盐酸，浓硫酸，75%酒精，氢氧化钠，过氧乙酸。【实验步骤】：一、无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、换好拖鞋。3.用75％酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌。4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。二、器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用三蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干。旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）。5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。