《细胞培养实验指导4.doc

细胞培养实验指导 陈轶霞 刘俊林 实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一 细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告) 实验二 细胞培养的设备与器材 【目的与要求】 1.了解细胞培养常用设备与器材； 2.掌握常用设备的基本操作程序及使用注意事项 【内容与方法】 1．通过教师讲解了解细胞培养常用设备的种类、使用注意事项以及常用器材。 2．通过教师讲解和演示，学生进行操作练习。 常用设备：C02培养箱、电热干燥箱、冰箱、倒置显微镜、超净工作台、过滤除菌装置、纯化水装置、细胞冷冻贮存器、离心机、天平、移液器、血球计数板、高压蒸汽消毒装置等。 常用器材： 玻璃器皿： 培养瓶、培养皿、离心管、注射器、储液瓶、吸管、载玻片、盖玻片、漏斗、烧杯、量筒等。 塑料品： 冷冻管、多孔培养板、离心管等。 器械： 解剖刀、眼科剪和镊、中号圆头镊、止血钳等。 橡胶制品：各种规格胶塞。 杂用品： 金属饭盒、试管架、记号笔、搪瓷盘、吸头、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶和火柴等。吸管筒等。 注：（不写实验报告） 准备实验要求：整理常用器械并置于瓷盘内，以便演示讲解。 实验三　　实验器材的清洗、包装和灭菌 【目的与要求】 掌握细胞培养常用实验器材的清洗、包装、灭菌方法以及注意事项。 【实验原理】 离体条件下，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，细胞培养器材清洗的要求要比普通实验的严格的多，应按不同器材的清洗、包装和消毒程序分别、分类处理。 【器材与试剂】 剪刀、棉绳、棉花、牛皮纸、记号笔、饭盒、吸管筒、烧杯、清洁液、三蒸水等。 【内容与方法】 1.各实验组准备后续实验所用的器材，如吸管、注射器、培养皿、青霉素瓶、盐水瓶、培养瓶、瓶塞、眼科剪及镊子等。 2.清洗步骤 浸泡于水中的使用过的玻璃器材、胶塞煮沸，加入适量洗涤剂继续煮10min→刷洗→流水振荡冲洗→沥水→清洁液浸泡24小时→流水振荡冲洗15～20遍→沥水→蒸馏水冲洗3次→50℃烤干，待包装。 3．包装 清洗后的培养瓶、培养皿、注射器、金属器械等器材用牛皮纸进行严密包装，封闭器材使用端，标记器材手持端，以便于消毒和贮存。吸管的手持端加棉塞后单独包装或放入吸管筒；瓶盖、胶塞包装（5-10个/包）或放入铝饭盒。 4．消毒 湿热灭菌：