常用实验基本技术细胞培养.pdf
常用实验根本技术〔续〕
山东大学医学院组胚教研室
史玮
四大常用根本技术
•逆转录-聚合酶链反响〔RT-PCR〕
•免疫组织化学技术〔免疫组化〕
•免疫印迹技术〔Westernblot〕
•细胞培养技术
局限性联合应用
细胞培养技术
•细胞培养〔Cellculture〕是指从生物体内取
出组织或细胞，在体外适当的条件下，使
之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功
能的方法。
•细胞培养便于应用各种方法和技术进行研
究，并可直接观察，已成为现代生物医学
研究中一项非常重要的技术。
培养细胞的生存条件
•无菌环境〔器皿、超净台〕
•超纯水
•温度〔37℃左右〕
•气体〔5%CO2/空气〕
•PH值〔7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱〕
•营养条件〔根底培养基+10%FBS〕
•渗透压、培养基质等
细胞培养用液
•平衡盐溶液：洗涤组织、细胞
•D-Hanks液、PBS液等。
•消化液：分散细胞
•0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者
混合使用
•培养液：细胞生存、生长和繁殖
•根底培养基(DMEM、RPMI1640等〕，
已商品化
•10%左右的胎牛血清〔FBS〕
培养细胞的来源
•直接取材：
实验动物、胚胎、临床标本等
•细胞系：
各实验室保存
细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、
中国医科院细胞中心
培养方式
•原代培养：
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。
只能原代培养：神经元、心肌细胞等。
•传代培养：
当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制，
需要分散稀释后重新培养。
常见：肿瘤细胞系
培养细胞的处理
•改变细胞外部因素
•改变细胞内部因素
外部因素
•药物
•高温
•低氧
•射线
•…
内部因素
改变细胞内基因表达水平：
上调：基因转染
下调：RNAi
细胞转染
•转染〔transfection〕是指将外源性DNA或
•RNA导入细胞的过程。
•上调目的基因表达：
•质粒载体
•病毒载体
•下调目的基因表达：
•化学合成siRNA
•质粒载体
•病毒载体
转染方法
•电转法
•脂质体介导的转染法
•病毒载体介导的转染法
•…
转染试剂
•脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如
Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。
•常用：Invitrogen公司Lipofectamine2000
可用来转染质粒siRNA.
•其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAX
TransfectionReagent专门用来转染siRNA.
瞬时转染与稳定转染
•瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA
不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收
集被转染的细胞进行基因表达分析。
•稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据
选择标记经过一段时间的筛选，使目的基
因整合入细