基因工程课件-第八章 第二代基因工程.pptx

第二代基因工程-----蛋白质工程;;;9.1 蛋白质工程的基本概念; 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。;一、蛋白质工程的概念 ;目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计与改造，定向改造或制造蛋白质。 实质：对编码蛋白质的基因进行改造。 前提：了解蛋白质的结构、功能及理化性质等;蛋白质工程的研究内容;改变蛋白质的遗传信息;第一个成功的GFP突变体;;设计理念;蛋白质工程的研究内容;蛋白质工程实施的必要条件;15;蛋白质分子结构的4个层次;蛋白质的一级结构（氨基酸序列）决定它的高级结构，是阐明蛋白质生物功能的分子基础。;二级结构：蛋白质主链折叠产生的有规则构象，主要有?-螺旋、?-折叠片、?-转角和无规卷曲等。结构复杂的蛋白质分子就由 这些比较简单的二级结构元件 进一步组合而成。 ;超二级结构（super-secondary struture， 结构模体 struture motif ）：相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合或二级结构串，其充当三级结构的构件。 ;蛋白质的三级结构：蛋白质分子在二级结构或超二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象，即一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。;蛋白质的四级结构：专指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。;23;24;一级结构测定;蛋白质三维结构测定;27;28;常用的蛋白质一级结构数据库;30;31;32;33;34;步骤如下： 1、分离纯化需要改造的目的蛋白； 2、对目的蛋白进行氨基酸序列分析、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等分析；或同源建模等得到三维结构； 3、获取编码目的蛋白的基因序列； 4、计算机模拟，分子对接，设计改造方案； 5、对基因序列进行改造（定点突变等）； 6、将改造的基因片段连入合适的载体表达； 7、分离、纯化表达产物并对其进行功能检测。;9.2 基因的体外定向突变方法;PCR扩增突变法;重叠延伸PCR法示意图 ;大引物PCR诱变法示意图 ;重组PCR定点诱变???（一步反向PCR法 ）;插入突变;缺失突变;9.3 基因的体外定向进化;分子定向进化的主要过程;定向进化的原理; 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。;;;;;定向进化与自然进化的异同点;易错PCR;易错PCR技术;(2)易错PCR反应条件 ① Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。普通PCR Mg2+浓度0.5-2.5mmol/L，易错PCR提高Mg2+浓度。 ② 添加Mn2+ ，以降低聚合酶对模版的特异性。 ③ 4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加。;;56/138;采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。 突变频率太低，难于筛选到理想的正突变体 突变频率太高，增加筛选工作量（大多突变为负突变和中性突变） 一般情况下, 一个目的基因通过易错PCR引起的错配碱基数目控制在2-5个。 通常采用连续易错PCR ( Sequential error prone PCR) ： 将一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的模板, 连续反复进行随机诱变。 ;;易错PCR应用;DNA重排技术;DNA重组装原理图 (DNA shuffling);;;交错延伸;65/138;体外随机引发重组;67/138;与常规DNA 改组相比,RPR 技术有如下优点:;一种简便快速的定点突变的方法;70;杂合酶;目标酶;;高通量筛选技术;1、平板筛选法;76/138;豆豉纤溶酶（douchi fiberolytic enzyme，DFE）;产物显色筛选;荧光产物筛选;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用;9.4 蛋白质工程的设计思想与应用