第八章 基因工程下游技术课件.ppt

第八章

基因工程下游技术;一、概述;基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它利用人工方法从某一种生物中取得特定的DNA片段，称目的基因。将目的基因通过基因载体运送到受体宿主活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。

;生物技术工业经过多年努力，创造了35种重要治疗药物，年销售额已超过70亿美元。全球已有生物技术制药公司2000多家，其中美国有1300家，欧洲有700家。1997年美国的生物技术研究与开发费用为76亿美元、欧洲为18亿美元。目前主要生物技术公司多分布在美国，如Amgen、Geneticsinstitute、Genzyme、Genentech和Chiron，还有Biogen也发展较快。经上市的生物技术药物主要含3大类，即重组治疗蛋白质、重组疫苗和诊断或治疗用的单克隆抗体。;二、基因工程产品的生产过程;原始材料

菌种、载体、工具酶、培养基等

上游过程

对菌种加以改造，提高生产能力或者导入外源基因等以获得工程菌，基因工程是方法之一。

发酵或生物转化

通过优化发酵条件如温度、营养、供气量等进行发酵或大规模培养，利用工程菌的生物合成、加工和修饰等获得目的产物。

储备菌种→种子罐培养作为发酵的菌种→发酵（涉及发酵罐、培养基优化、发酵条件优化等）。

动植物的细胞培养：悬浮培养、固体培养；自动化控制。;利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。

就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后??是单一的微生物细胞;

从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的表达。

外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。

;工程菌高密度发酵;下游过程

指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包括固液分离技术（离心、过滤、沉淀等）、细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空干燥、冰冻干燥等），是运用生物化学、物理学方法分离、纯化产品，最终将产品推向市场并获得社会或经济效益的过程。;基因工程产业化除上游构建工程菌之外,下游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天然结构使之具有生物活性、表达产物的修饰加工等。

就基因工程产业化而言,下游技术的研究与建立是十分重要的,又是十分耗时的,需要远比上游研究多得多的投资。;（1）菌体的处理。微生物或动植物细胞培养的产品是细胞或培养液，均应将它们分开，分别处理。发酵过程除增殖大量菌体外还有许多残渣混在发酵液中，可通过适当加热，调整酸碱度或添加絮凝剂，使菌体与发酵液分离。悬浮液中的菌体通过过滤或离心法将之分开。除加助滤剂外可用真空过滤以提高效率。离心法常用自动间歇排渣离心机或喷射型离心机。菌体分离后要经灭活处理并将菌体破碎。物理破碎可用研磨法或挤压法制成匀浆，超声波振荡法使介质引起空化而产生冲击波。酶处理可以专一地催化细胞壁水解，裸露的原生质体在低渗条件下进一步破裂而释放出细胞内含物。

（2）胞外产物——上清液的处理。除去菌体后的上清液可通过加热或调整pH以除去杂质蛋白，如絮凝剂萃取法分离青霉素G；用等电点法将谷氨酸(味精)沉淀；一些酶制剂可用一定浓度的硫酸铵盐析析出。色谱分离法采用不同的树脂及溶剂系统，根据产物在该系统中不同的分配而被吸附或凝聚而得以分离。其中亲和色谱法用于酶或蛋白的分离和精制效果良好。

（3）最后纯化产品经分装冻干，包装后即为成品。

;与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,在进行任何一种蛋白质纯??工艺设计之前,都需要尽可能多地先对提纯的体系,目标蛋白和杂质的性质进行了解。如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢