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免疫组织化学 报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群 何谓免疫组化 免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。 标本的处理 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞 标本的固定与保存 酶消化处理 标本的固定与保存 标本的固定与保存 标本的固定与保存 酶消化处理 抗体处理与保存 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法） 免疫染色 免疫组化染色中标识物的选择 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定 设立对照实验 免疫组化的结果判断 几种常用的免疫组化检测技术 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 免疫标记电镜技术 …… 免疫组织化学技术的应用 免疫组化在临床病理诊断中的应用 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; 协助肿瘤良恶性的诊断; 鉴别低分化癌和肉瘤; 鉴别转移癌的性质; 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; 鉴别小细胞恶性肿瘤; 癌组织耐药基因的检测; 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; 确定肿瘤组织的增殖活性; 评估癌症患者的预后; 检测病原体。 鉴别低分化癌和低分化肉瘤 鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤 鉴别微小转移癌灶 鉴别某些转移癌的类型 鉴别低分化癌的类型 鉴别低分化肉瘤的类型 谢谢！ 傅琦博 F0318102 傅琦博 F0318102 傅琦博 F0318102 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记物与抗体集合形成标记抗体 标本的处理 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜下观察结果 组织抗原 抗体 标记物 标记抗体 1 荧光 2 酶 3 亲和技术 4 金标 组织抗原 免疫细胞化学反应原理： ＋ 标记抗体 标记的抗原抗体复合物 间接法 直接法 两种免疫细胞化学反应方法 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。 好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应 室温，2min 1％聚甲醛 细胞悬液 室温，3～10min 10％甲醛 类脂质 4 ℃ ，30～60min 四氯化磺 室温，5～10min 丙酮，无水乙醇 病毒 室温，3～10min 丙酮、甲醇 细菌 4 ℃ ，4～5h 1％聚甲醛 激素 4 ℃ ，30min 四氯化磺 酶 4℃，30min 丙酮 免疫球蛋白 室温，3～15min 95％乙醇 蛋白质 固定温度与时间 固定剂 抗原 各种抗原的固定 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。 冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。 石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。 免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。 对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。 1.蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。 2.非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的