组织化学技术5-免疫组化.ppt

第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（Immunohistochemistry） 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织 内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原 位检测技术。 1．发展简史 ——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 —— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁 蛋白标记Ab技术。 —— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立 辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP ）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。 —— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC） 法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世。 —— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展。 ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综 合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各 个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基 本技术之一。 2．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 （2）根据Ag—Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 （3）按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） 3．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。 （2）常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rho—damine RB200） ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护 难一般不用） 4．应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。 一、免疫组织化学技术 （一）染色方法 1．直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上） 荧光显微镜下观察→检测抗原。 △ 酶标抗体要显示后镜检。 (2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系 4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法） ~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复 合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。 （1）ABC复合物的制备： （2）ABC法反应原理 6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）Streptavidin/pe