实验二 免疫组织化学技术.ppt

阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性 原因： 标本固定不当 抗体试剂问题：浓度、效价低 抗原修复不当 显色时间短 免疫病理学技术在科研及临床中的运用 免疫病理学 一、免疫细胞化学 二、免疫组织化学 三、免疫荧光组织化学 一、免疫细胞化学 1、定义：利用已知抗体检测细胞爬片上细胞是否存在相应的抗原。 2、原理：抗体+细胞抗原----显色 3、运用：检测相关基因的表达 二、免疫组织化学Immunohistochemistry, IHC 原 理 用 途 试剂配置 操作步骤 ＋ 标记抗体 标记的抗原抗体复合物 免疫组织化学反应原理 组织抗原 1 荧光素 2 酶标 3 金属离子 4 同位素 HPR-DAB显色呈棕黄色 间接法:灵敏性 三步法、两步法 直接法：特异性 一步法 两种免疫组织化学反应方法 亲和素-生物素方法（三步法）：ABC、SP法 多聚螯合物酶法（两步法）：Supervision法 用 途 临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：CK，EMA 间叶来源：Vimentin 淋巴组织: LCA 科研：组织抗原表达情况 试剂准备 切片(防脱片) 多聚赖氨酸, APES 一抗 多抗or单抗,兔or鼠, 注意种属特异性，针对检测组织种属 检测试剂盒 EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法） SP试剂盒（三步法）链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法 SABC试剂盒（三步法） 显色试剂盒 DAB试剂盒 其他 H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清 （1）使用多聚赖氨酸防脱载玻片贴4μm石蜡切片。 （2）58℃烤片4小时。 （3）切片脱蜡至水。 （4）蛋白酶消化或抗原热修复（此步视一抗及组织具体情况而定）。 （5）PBS洗3min×3次。 （6）组织切片于室温下置于3% H2O2水溶液中15-20min以阻断 内源性过氧化物酶。 （7）PBS洗3min×3次。 （8）滴加非免疫动物血清，室温孵育20min，封闭抗体非特异性 结合位点。 NO1. 前期处理（抗原准备阶段） 免疫（酶）组织化学基本步骤 （9）甩去非免疫动物血清，直接滴加适当稀释的特异性一抗， 37℃孵育90-120min。 （10）PBS洗3min×3次。 （11）滴加二抗（二抗操作步骤视选用的免疫酶组织化学方法而定） （12）PBS洗5min×3次。 （13）DAB或AEC显色3-10min，显微镜下监控显色程度，水洗。 （14）苏木精复染，水洗。 （15）1%盐酸酒精分化数秒，水洗。 （16）饱和碳酸锂水溶液返蓝，水洗。 （17）梯度酒精脱水，透明，封片。 NO2. 免疫反应阶段 NO3. 显色反应阶段 结果分析和判断 （1）判断原则 （2）对照设计 （3）非特异染色 （4）失败的原因及其处置方法 （1）判断原则 必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照 抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化 阴性 CK—胞浆阳性 胞浆阳性 细胞核阳性---PCNA 胞核阳性 胞膜阳性 胞膜阳性 （2）对照设计 阳性对照：已知阳性表达的组织 自身对照：同一标本中不同组织对照 阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照 （3）非特异性染色 原因 组织内源性成分的干扰： 内源性过氧化物酶---白细胞，红细胞 内源性生物素---肝、胰、肾组织 组织处理不当： 内源性过氧化物酶---白细胞，红细胞 内源性生物素---肝、胰、肾组织 （3）非特异性染色 处理方法 抗体：纯化，浓度，时间，温度 封闭：H2O2， 非免疫动物血清 清洗：充分 显色：时间 其他：脱蜡充分，无干片 （4）染色失败的原因及处理方法 试验片：- 阳性对照片：- 阴性对照片：- 空白对照片：- 结果：假阴性 原因： 操作步骤？ 试剂？ 试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：+ 空白对照片：+ 结果：假阳性 原因： 切片干涸 抗体浓度过高 缓冲液配制不对 冲洗不彻底 显色液配制不对 显色时间过长 载玻片的粘合剂过厚 试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：- 空白对照片：+ 结果：假阳性 原因： 非特异染色，与二抗交叉反应。 试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：+ 空白对照片：- 结果：可疑阳性 原因： 阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原 试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：- 空白对照片：- 结果：阳性 原因： 方法可靠，实验片含靶抗原。