免疫组织化学试验.PPT

实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min； 2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min； 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37℃ 孵育1hr； 4、 PBS冲洗，3×3min； 5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37℃或室温孵 育20～30min； 6、 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（AEC或DAB）； 8、自来水充分冲洗，封片。 结果：胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质。 * * 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素－生物素法（SAP法） 免疫组织化学实验二 实验材料 1、小鼠胰腺的石蜡切片； 2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）； 3、SAP检测试剂盒； 4、正常羊血清； 5、 0.01M PBS（pH7.2～7.6） ； 6、BCIP/NBT显色试剂； 7、孵育湿盒。 实验原理 ABC法 SAP法 实验方法或步骤 1、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，PBS浸泡2min；(如需采用 抗原修复，可在此步后进行)。 2、10％正常羊血清封闭，室温孵育10min； 3、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工 作液，37℃孵育45min。 PBS冲洗，3×3min； 4、滴加生物素标记羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育20min； 5、 PBS冲洗，3×3min； 6、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液，37℃或室温孵育 20min。 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（BCIP/NBT）； 8、自来水充分冲洗，封片。 结果 胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质 多聚鳌合物酶法 HRP---多聚化合物---抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining 组织抗原 一抗 HRP 多聚化合物骨架 EPOS 方法 原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚化合物---特异 性抗体。 步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵 二、EnVision法（或PowerVison） Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP ---多聚化合物---第二 抗体 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚化合物骨架 第一步 第二步 PowerVision方法 特点： 敏感性高：（每个多聚鳌合物中含70个 HRP分子和10 个第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。 基本操作步骤 1. 抗原修复 2.内源性过氧化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体 5. 多聚骨架复合物 6. 显色