细胞培养常用试剂的配制.doc

细胞培养常用试剂的配制 日期：2012-04-13?来源：未知?作者：网友?点击：239次? 相关专题  HYPERLINK /zt/cell/45828.html \t _blank 细胞培养基的配制  HYPERLINK /experiment/cell/Cellculture.html \t _blank 细胞培养专题  HYPERLINK /zt/product/pbs.html \t _blank 万能缓冲液PBS 器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等 具体步骤 1、水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水. 2、PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗 溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4%26middot;H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。 移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 3、胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 4、0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液 称取胰蛋白酶粉末(1：250) 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于-20℃保存。 5、青、链霉素溶液： 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。 6、RPMI1640： 溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。 7、血清的灭活： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 8、HEPES溶液： HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N%26rsquo;-a-hydroxythylpiperazine-N%26rsquo;- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下： 准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。 注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：