实时定量PCR技术原理及应用.ppt

提纲 什么是PCR? PCR→生命科学的革命 什么是PCR? PCR定义：聚合酶链式反应 用途：用于体外扩增DNA，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大上亿倍。 反应步骤： 1.变性 2.退火 3.延伸 PCR特点：特异性强、灵敏度高 什么是PCR? 实时荧光定量PCR 定量PCR：在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。 在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。 自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。 与普通PCR的区别 与普通PCR的区别 与普通PCR的区别 实时荧光定量PCR的重要概念 基线：PCR开始时信号很低，接近背景且比较平稳的那段。 一般是样本的荧光背景和阴性对照的荧光值 荧光域值：?以PCR反应的前15?个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号的标准偏差的10?倍。 实时荧光定量PCR的重要概念 Ct值：也称循环域值，指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于荧光域值。 经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn）成反比 实时荧光定量PCR的重要概念 实时荧光定量PCR的重要概念 关系 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR原理 实时定量荧光PCR的数据分析 实时定量荧光PCR的数据分析 实时定量荧光PCR的应用 ?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 ?相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 绝对定量与相对定量 绝对定量 绝对定量--标准品 绝对定量—从荧光到拷贝数 绝对定量 绝对定量 绝对定量 相对定量 相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 相对定量分析 相对定量分析 谢谢！ 请提问和讨论 作为一个由外来病原体入侵引起的疾病，病原体在体内的存在以及数量是判断疾病有无和病情严重的最终判断标准。 HBV-DNA是直接反映HBV复制状态及传染性的最佳指标。根据《2001年拉米夫定临床应用专家共识》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的之一就是要降低血清HBV-DNA 目前定量PCR的应用已经可以完全定量的对乙肝病毒的数量进行定量分析，并且这种分析是建立在对病毒本身DNA直接检测的基础上 作为一个由外来病原体入侵引起的疾病，病原体在体内的存在以及数量是判断疾病有无和病情严重的最终判断标准。 HBV-DNA是直接反映HBV复制状态及传染性的最佳指标。根据《2001年拉米夫定临床应用专家共识》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的之一就是要降低血清HBV-DNA 目前定量PCR的应用已经可以完全定量的对乙肝病毒的数量进行定量分析，并且这种分析是建立在对病毒本身DNA直接检测的基础上 作为一个由外来病原体入侵引起的疾病，病原体在体内的存在以及数量是判断疾病有无和病情严重的最终判断标准。 HBV-DNA是直接反映HBV复制状态及传染性的最佳指标。根据《2001年拉米夫定临床应用专家共识》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的之一就是要降低血清HBV-DNA 目前定量PCR的应用已经可以完全定量的对乙肝病毒的数量进行定量分析，并且这种分析是建立在对病毒本身DNA直接检测的基础上 作为一个由外来病原体入侵引起的疾病，病原体在体内的存在以及数量是判断疾病有无和病情严重的最终判断标准。 HBV-DNA是直接反映HBV复制状态及传染性的最佳指标。根据《2001年拉米夫定临床应用专家共识》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的之一就是要降低血清HBV-DNA 目前定量PCR的应用已经可以完全定量的对乙肝病毒的数量进行定量分析，并且这种分析是建立在对病毒本身DNA直接检测的基础上 病毒是引起病毒性肝炎的直接根源 病毒性肝炎的治疗是降低/消除体内病毒 病毒数量变化是治疗效果最直接的指标 总结一下乙肝DNA的临床意义。第一，由于乙肝是外