《实时定量PCR技术及其应用》课件.ppt

**药物敏感性评价药物筛选筛选有效药物，评估药物对癌细胞的敏感性个性化治疗根据患者基因型选择最佳药物方案治疗效果监测监测药物治疗效果，评估药物疗效优缺点及注意事项优点灵敏度高、特异性强、定量准确、操作简便缺点成本较高，需要专业仪器和人员注意事项实验设计要严谨，避免人为误差实时定量PCR数据分析数据分析软件使用专门的软件进行数据分析结果解读根据数据分析结果进行科学的解读实验设计1确定目标基因选择与研究课题相关的目标基因2选择合适的探针根据目标基因序列选择合适的探针3设计实验方案确定实验组、对照组、样本量和重复次数样品准备1样品收集收集研究对象的相关样本2样品处理对样本进行处理，提取核酸3样品保存将提取的核酸妥善保存标准曲线绘制标准品准备准备已知浓度的标准品PCR反应对标准品进行PCR反应曲线绘制根据标准品浓度和Ct值绘制标准曲线阈值循环值计算阈值设定根据实验要求设定合适的阈值Ct值计算根据阈值计算每个样本的Ct值结果分析与解释数据分析根据Ct值进行定量分析结果解读结合实验设计和研究目的解读实验结果总结与展望实时定量PCR技术已成为分子生物学研究的重要工具，在医学、农业、环境等领域发挥着重要作用。未来，随着技术的不断发展，实时定量PCR技术将应用于更广阔的领域，为人类健康和社会发展做出更大的贡献。***********************实时定量PCR技术及其应用本课件将深入介绍实时定量PCR技术的原理、应用和最新进展，以及如何有效地利用这项技术进行科研和临床研究。课程目标理解实时定量PCR技术掌握实时定量PCR技术的基本原理和应用领域。掌握实验操作了解实时定量PCR实验设计、仪器操作和数据分析方法。应用于科研与临床能够独立应用实时定量PCR技术进行基因表达分析、病原体检测等研究。PCR技术基本原理1DNA模板目标基因的DNA片段2引物与目标基因两端互补的短序列3dNTPDNA合成所需的脱氧核苷酸4Taq酶耐热DNA聚合酶，催化DNA复制5PCR循环重复进行变性、退火、延伸，实现目标基因扩增实时定量PCR工作原理1循环扩增PCR反应进行的同时，检测扩增产物量的变化2荧光信号利用荧光探针或染料检测扩增产物的积累3实时监测实时监控荧光信号强度，确定起始模板量实时定量PCR与传统PCR的区别传统PCR通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，无法定量实时定量PCR实时监测扩增过程，可以定量分析起始模板量实时定量PCR的优势1灵敏度高可以检测极微量的目标基因2特异性强利用荧光探针或染料特异性识别目标基因3定量准确实时监测扩增过程，定量分析起始模板量4操作简便自动化程度高，减少人为误差实时定量PCR应用领域基因表达分析研究基因表达水平的差异病原体检测诊断感染性疾病遗传病诊断检测遗传病相关的基因突变药物敏感性评价评估药物对癌细胞的敏感性核酸抽提和纯化1样品裂解破坏细胞膜，释放核酸2核酸结合使用试剂分离和纯化核酸3洗脱将纯化的核酸溶解在缓冲液中荧光探针及其种类TaqMan探针利用5核酸酶活性降解探针，释放荧光信号分子信标探针探针自身形成茎环结构，扩增时打开，释放荧光信号SYBRGreen双链DNA结合染料，结合到扩增产物上，产生荧光信号TaqMan探针探针设计设计与目标基因序列互补的探针探针标记探针标记荧光报告基团和淬灭基团PCR反应Taq酶降解探针，释放荧光信号分子信标探针探针结构探针自身形成茎环结构，荧光基团被淬灭基团阻挡扩增过程探针与目标基因序列结合，打开茎环结构，释放荧光信号信号检测实时监测荧光信号强度，定量分析起始模板量SYBRGreenSYBRGreen特点SYBRGreen是一种双链DNA结合染料，可以与任何双链DNA结合优势价格低廉，操作简便缺点特异性较低，易产生假阳性实时定量PCR仪器平台1ABI7500广泛应用于科研和临床2RocheLightCycler具有快速加热和冷却系统3Bio-RadCFX96高通量分析，可同时检测多个样本实时定量PCR仪器组成热循环系统控制温度变化，实现PCR反应荧光检测系统实时检测荧光信号强度数据处理系统收集和分析数据，生成定量结果实时定量PCR反应步骤1样品准备准备模板、引物、探针和反应试剂2反应设置将反应混合物加入PCR管中3仪器运行将PCR管放入仪器中，进行PCR反应4