《实时荧光定量PCR技术原理》课件.ppt

********************实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种新型的核酸定量技术，它能够在PCR反应过程中实时监测反应体系中扩增产物的积累，从而实现对目标基因的定量分析。该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、速度快等优点，已成为生命科学研究和临床诊断中的重要工具。PCR技术发展历程11983年，美国科学家KaryMullis发明了PCR技术，为生物学研究开辟了新纪元。21990年代初期，实时荧光定量PCR技术应运而生，克服了传统PCR技术的不足，实现了对目标基因的定量分析。321世纪初，实时荧光定量PCR技术不断发展，出现了多种荧光探针和检测方法，应用范围不断扩大。PCR反应的基本原理PCR反应利用DNA聚合酶的活性，在特定引物和温度条件下，对目标DNA片段进行指数扩增。该技术通过对DNA模板进行循环加热和冷却，使DNA双链解链、引物退火和DNA聚合酶延伸，从而完成目标片段的扩增。PCR反应的关键步骤第一步：DNA模板的热解链。将反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，形成单链DNA。第二步：引物与单链DNA退火。将反应体系降温至55-65℃，使引物与模板DNA互补结合。第三步：DNA聚合酶延伸。将反应体系升温至72℃，使DNA聚合酶以引物为起点，沿着模板DNA链延伸，合成新的DNA链。DNA模板的获取细胞裂解利用物理或化学方法破坏细胞膜，释放出细胞内的DNA。DNA分离纯化通过离心、沉淀等方法，将DNA与其他细胞成分分离，得到纯化的DNA。引物的设计与选择特异性引物应与目标DNA片段的序列完全匹配，避免与其他基因的序列发生杂交。长度引物的长度一般为18-30个碱基对，太短会降低特异性，太长会降低效率。Tm值引物的Tm值应相近，一般在55-65℃之间，确保引物能够在合适的温度范围内与模板DNA退火。DNA聚合酶的特性1热稳定性能够耐受高温，在95℃的条件下仍能保持活性。2高保真性在DNA合成过程中，能够准确地识别模板DNA链，避免错误。3活性强能够快速高效地合成新的DNA链。dNTP、缓冲液的作用4dNTPs作为DNA合成的原料，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。1缓冲液维持反应体系的pH值稳定，保证DNA聚合酶的最佳活性。温度循环条件的优化1热解链温度一般为95℃，确保DNA双链完全解开。2退火温度根据引物的Tm值确定，一般在55-65℃之间，确保引物与模板DNA结合效率高。3延伸温度一般为72℃，保证DNA聚合酶在最佳温度下延伸，合成新的DNA链。荧光探针的种类与工作原理TaqMan探针：利用5核酸酶活性，在PCR反应中，探针被降解，释放出荧光信号。SYBRGreen探针：利用荧光染料与双链DNA结合，产生荧光信号，用于定量分析。标记荧光探针的结构报告基团能够发射特定波长的荧光信号。淬灭基团能够吸收报告基团发射的荧光，抑制荧光信号。探针序列与目标DNA片段的序列互补，在PCR反应中与目标DNA结合。实时荧光检测的方法测量荧光信号的仪器实时荧光定量PCR仪是一种专门用于实时监测PCR反应过程中荧光信号的仪器。它通常包含一个加热块、一个光学检测系统和一个数据分析系统。加热块用于控制PCR反应的温度循环，光学检测系统用于检测反应体系中的荧光信号，数据分析系统用于对荧光信号进行分析和定量。荧光信号的检测机制光激发仪器发射特定波长的光，激发荧光探针。荧光发射荧光探针吸收光能后，释放出特定波长的荧光信号。信号接收仪器的光学检测系统接收荧光信号，并将其转换成电信号。PCR扩增曲线的特点PCR扩增曲线一般呈S型，分为三个阶段：对数期、线性期和平台期。对数期是荧光信号快速上升阶段，线性期是荧光信号线性增加阶段，平台期是荧光信号趋于饱和阶段。Ct值的计算与意义Ct值是荧光信号达到设定阈值的循环数，它与目标基因的起始拷贝数成反比。Ct值越小，说明目标基因的起始拷贝数越高。相对定量分析的原理相对定量分析是将目标基因的表达量与内参基因的表达量进行比较，从而获得目标基因的相对表达水平。内参基因是指在不同样本中表达量稳定的基因，通常作为参照基因，用于校正样本间差异。绝对定量分析的方法绝对定量分析是通过已知浓度的标准品，构建标准曲线，然后根据待测样本的Ct值，在标准曲线上查找到相应的浓度值。该方法可以获得目标基因的绝对拷贝数或浓度。标准曲线的建立标准曲线通常由一系列已知浓度的标准品进行PCR反应，并将Ct值与相应的浓度值进行绘制。标准曲线应具有良好的线性关系，并具有较高的R平方值，才