吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法.PPT

　　静脉采血后，必须在1-2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免血细胞中的酶通过细胞膜进入血清而引起误差。血细胞被分离后，因血中C02丧失极快，可使pH在15min内由7.4增至8.0，对碱性敏感的ACP活性因而急剧下降。应避免因抽血不当或急于分离血清而引起的体外溶血。 2.抗凝剂 草酸盐、枸橼酸盐和EDTA等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需要Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5’-NT；草酸盐既可与丙酮酸或乳酸发生竞争性抑制，又能与LD或NADH或NAD+形成复合物，从而抑制催化的还原或氧化反应。枸橼酸盐、草酸盐对CP、ChE均有抑制作用；EDTA还能抑制ALP；氟化物也可抑制ChE。故用上述抗凝剂分离之血浆一般不宜做酶活性测定。 肝素是粘多糖，对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响，适于急诊时迅速分离血浆进行测定，但需注意的是对CK等酶有轻微抑制作用。为避免上述影响，临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶活性，一般都不采用血浆而采用血清为首选测定样品。 3．温度 血清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶(如 AST、γ-GT和ALP等)存在于清蛋白中，可在室温保存l～3天，而活性不受影响。故室温中较稳定的酶类甚至可快速邮件送检；有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50％。大部分酶在低温中比较稳定，一般至少应在血清分离后的当天进行测定，否则应放冰箱冷藏。 5．沉淀形成 使用分光光度法测定酶活性时，如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化。常加入表面活性剂以防止颗粒从匀浆中析出。有些酶反应需镁离子作为辅因子，如反应液中含有多余磷酸根时将有沉淀出现。 解决上述干扰问题的方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正。即有时不仅要作标本对照管，还要作试剂空白管。另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。 四、工 具 酶 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常使用酶偶联体系进行测定，指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。 (一) 常用工具酶及其质量要求 常用工具酶多为氧化还原酶类，这是因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。在一系列利用工具酶的反应中，主要限速因子应该是待测化合物和待测酶，工具酶和其辅助底物应过量。 (二)工具酶参与的指示反应 近年来，在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通(或通用)反应途径。 最常用的有两类分光光度法： 一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢(H2O2)，再加氧化发色剂比色； 一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)—NAD(P)H的正／逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。 1．偶联H202的工具酶及其指示反应 临床化学测定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸的测定，可使相应底物被氧化生成H202。H202主要通过以氢(或电子)为受体的指示酶和以NAD(P)H为辅酶参与的两类指示反应进行检测。前者主要有两类工具酶参与反应：过氧化氢酶或称触酶(catalase)及过氧化物酶(peroxidase,POD)，两者均为含三价铁的指示酶。以指示酶POD最为常用，主要催化以下两种反应。 一种是在POD的直接催化下，H202氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此类色素原供氢体有邻联甲苯胺(OT)、联苯胺(DAB)、邻联茴香胺(ODA)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。其中只有TMB无致癌性，且其生色的灵敏度最高。 2．NAD(P)+或NAD(P)H偶联的 脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶的脱氢酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的氢原子去除后传递给NAD(P)+而形成NAD(P)H。LD主要以NAD+／NADH为辅酶，而GLD则不论来自肝或细菌，均可以NAD+／NADP+或其还原型为辅酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法进行检测。目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、β-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD和lCD等。 为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为