【2017年整理】GENMED真菌酵母细胞半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书.doc

PAGE PAGE 2 GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60013.2 v.A GENMED真菌/酵母细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 GENMED真菌/细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学和物理方法，快速有效地裂解真菌细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以邻硝基苯基-β-D- 半乳糖苷为无色底物，水解所产生的亮黄色的邻硝基酚，即采用比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此建立一种简单的定量评价报告基因的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的真菌/酵母活体细胞分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感，堪称国际上同类产品最佳。 技术背景 大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一种无色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和亮黄色的邻硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通过420nm波长的吸光值分析，来测定β-半乳糖苷酶的活性单位。 ? 产品内容 GENMED裂解液（Reagent A） 10毫升 GENMED强化液（Reagent B） 2毫升 GENMED活性液（Reagent C） 250微升 GENMED稀释液（Reagent D） 20毫升 GENMED反应液（Reagent E） 4毫升 GENMED终止液（Reagent F） 10毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent C）和GENMED反应液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED反应液（Reagent E）避免光照；有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 （微型）台式离心机：用于样品操作 比色皿或酶标板：用于比色分析的容器 恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育 计时器：用于反应计时 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为28℃。同时从－20℃冰箱里取出GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent C）和GENMED反应液（Reagent E）置于冰槽里融化；GENMED反应液（Reagent E）避免光照。然后进行下列操作： 样品准备 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升） 移入到预冷的15毫升锥形离心管 置于冰槽里5分钟 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g 小心抽去上清液 加入250微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混匀 转移到预冷的1.5毫升离心管 加入100微升GENMED强化液（Reagent B） 加入12.5微升GENMED活性液（Reagent C） 强力涡旋震荡15秒 置于冰槽里1分钟 重复实验步骤10至11五次 加入250微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混匀 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 活性检测 方法一：常规检测（比色皿） 移取100微升上述制备的细胞裂解悬液样品到新的比色皿 加入900微升GENMED稀释液（Reagent D） 上下倾倒数次，混匀 放进28℃恒温水槽孵育5分钟 加入200微升GENMED反应液（Reagent E）（注意：使用前，充分混匀GENMED反应液（Re