特异性引物GSP对玉米丝黑穗病苗的检测效率.doc

特异性引物GSP对玉米丝黑穗病苗的检测效率 　　0、 引言 　　玉米作为中国乃至全世界第一大粮食作物,是重要的粮食作物和饲料来源,同时也是全球总产量最高的经济粮食作物. 而玉米丝黑穗病作为一种全球性的病害已经严重的影响了全球各地玉米的产量,同时也是制约我国玉米产业快速发展的主要病害之一. 玉米丝黑穗病又名乌米、哑玉米等,在华中、华北、华南、东北、西北和西南地区都普遍发生. 2002 年东北地区玉米丝黑穗病大面积的发生,其平均发病率为 10% ~ 15%,严重的地区高 70% ~ 80%. 随着玉米感病品种的大规模种植,玉米丝黑穗病的发病率一年高过一年,并且已经成为了危害我国玉米产量的重要病害. 因此,寻找一种能够快速且有效的方法对玉米丝黑穗病进行检测显得尤为重要,为研究丝孢堆黑粉菌的致病机理,寻找防治该病害的新途径、新方法提供技术支持. 　　在对植物进行某种病原检测中,通常使用的是 PCR 检测技术. PCR 技术用来检测病原物是指选择某一特定的引物去扩增相应的目的 DNA片段. 该实验所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米丝黑穗病菌的特异性引物(GSP) ,然后采用 PCR 扩增检测技术可以对玉米病苗中的丝黑穗病菌基因组进行特异性的扩增,对扩增的样品 DNA 进行浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳,最后在凝胶成像系统中进行观察和记录,从而得知玉米是否感染了丝黑穗病. 最后计算出该特异性引物 GSP 对玉米病苗的检测效率,看是否可以用于快速有效的对玉米感病植株在发病之前对病菌进行检测. 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料准备 　　(1) 丝黑穗冬孢子的观察 　　称取 10 mg 已经处理好的玉米丝黑穗病菌冬孢子粉,将其置于 1. 5 mL 的离心管中,加入适量的无菌水浸泡过夜,然后置于高速离心机中离心 2 min(10000 r/min) ,弃掉上清液. 再用无菌水处理 1 d,再次离心并弃掉上清液. 将已经处理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的 2% 葡萄糖溶液中,置于 28 的温箱中黑暗培养3 d,3 d 后观察冬孢子的萌发状态. 　　(2) 试验材料及病菌 　　玉米感病品种(黄早 4) ,植物 DNA 提取试剂盒(宝生物公司购买) ,供试丝黑穗病菌(将事先收集好的病菌样品置于室内晾干,再用筛子充分筛选出孢子粉,将孢子粉置于通风、阴凉、干燥处保存备用) . 　　(3) 配置菌土 　　土壤采样后放入高压灭菌锅中进行灭菌,待土壤冷却后加入玉米丝黑穗菌粉配置成 1% 的菌土. 　　(4) 播种与接种 　　选取 200 粒感病品种黄早 4,将种子在 4 月20 日播种于吉林省农业科学院所属的玉米试验田(公主岭) ,每穴 2 ~3 粒,将配置好的菌土覆盖在玉米种子上. 　　(5) 取样 　　在玉米抽穗前期(此时病状并未表现出来)对玉米的根与叶片组织进行采样. 　　1. 2 试验方法 　　1. 2. 1 DNA 的提取方法(采用试剂盒提取,提取方法参照说明书) 　　将采集的每份玉米根与叶片的样品取适量置于研钵中用液氮充分的研磨,将研磨好的样品组织(不多于 50 mg) 分装于 1. 5 mL 的离心管中,并分别做好标记. 加入400μL LE Buffer,上下颠倒混合均匀,迅速置于 65 环境中温浴 15 ~30 min(期间可震荡离心管 2 - 3 次) ,然后移出. 　　然后向离心管中加入 130 μL DA Buffer,充分混匀,在冰盒中放置 5min,再放入 Sigma 微量台式离心机中 14000 r 离心3 min,待离心完成后用移液器吸取上层清液,将上清液转移至一个已灭菌的 1. 5 mL 离心管中. 加入 750 μL 的 E BindingBuffer(使用前已按说明加入了 28 mL 的无水乙醇) ,上下颠倒混匀后将混合液转移至 Spin col-um 中,在高速离心机中 6000 r 离心 1 min,并倒掉接液管中的液体,因为此时的混合液体积大于750 μL,所以需要分 2 次进行离心过柱. 之后向Spin colum 中加入 500 μL 的 G Binding Buffer,于10000r 离心 30s,并倒掉接液管中的液体. 在 Spincolum 中加入 600 μL 的 Wash Buffer(使用前已按说明加入了 37. 8 mL 的无水乙醇) . 于 10000 r离心 30 s,倒掉接液管中的液体,再重复此步骤一次. 然后将 Spin colum 转移至一个新的1. 5 mL的离心管中,向其中加入 100 μL 的 Elution Buff-er,放于室温温浴 1 min 后,最后于离心机中12000 r 离心 1 min,并弃掉 Spin colum,此 1. 5 mL的离心管中的液体含有