第2节其他重要工具酶.ppt

第二节 其它重要的工具酶;DNA 聚合酶（DNA polymerase）;DNA 聚合酶 I;实验室中，利用 DNA 聚合酶 I，通过 DNA 缺口平移的方法制备 DNA 探针，可以用于核酸杂交分析。 双链 DNA 的单链缺口在 DNA 聚合酶 I 的 5?→3?外切作用下，从缺口的5‘端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的 3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移。 如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的 DNA 分子即可作为带放射性标记的 DNA分子杂交探针。;DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段);用途： 用随机引物制备探针 补平5?突出端，形成平末端 切除3?突出端，形成平末端 合成cDNA第二条链 诱变反应中第二条链的合成 双脱氧法DNA序列测定 (Sanger 法);DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段);T4 DNA 聚合酶;T4 DNA 聚合酶;DNA片段的末端平滑化示例;T7 DNA 聚合酶;T7 DNA聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的 DNA 聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。 除聚合活性以外，T7 DNA 聚合酶还具有单链和双链的 3‘→5’外切酶活性，它的活性也很强，约为 Klenow 酶的 1000 倍。 T7 DNA 聚合酶不具有 5‘→3’外切酶活性。由于 T7 DNA 聚合酶的高度续进性和不受 DNA 二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板 DNA 的引物延伸反应。同时，经修饰的 T7 DNA 聚合酶还是双脱氧终止法对长片段 DNA 进行测序的理想工具酶。; 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase） ;从细菌中分离的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, E.coli C75; BAP) 从小牛肠中分离的碱性磷酸酶 (Alkaline phosphase, calf intestinal, CAP)。 从虾提取的虾碱性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP ） ; 碱性磷酸酶;T4 多聚核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinase，PNK） ;双链DNA片段的磷酸化;;DNA 酶 I （DNase）; 用 途 1）与DNA Polymerase I 一起用于切口平移（Nick translation）。 2）在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shot gun sequencing）制作DNA文库。 3）用于足迹法（Foot printing）分析DNA-蛋白质相互作用。 4) DNase I 可以作用于单链 DNA、双链 DNA、染色质和RNA:DNA杂交链。 ;;RNA酶A（Ribonuclease A） ;;质粒提取后用RNA酶处理;其它的RNA酶;防护RNA酶的污染;末端转???酶的主要用途;末端转移酶的主要用途;末端转移酶的主要用途; D N A 连接酶;DNA 连接酶的分类;大肠杆菌 DNA 连接酶催化的连接反应中所需要的能量由 NAD+提供， T4 DNA连接酶催化的反应中所需要的能量由 ATP 提供。其他方面大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶的作用机制相同。;;;反转录酶;反转录酶的主要作用是将 mRNA 转录成双链 cDNA，并可用反转录的 cDNA 进行序列分析，再推导出 RNA 序列。;Taq DNA 聚合酶;;;