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检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3. 双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。5. 荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近（100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统  （ 3） 组织内蛋白的免疫共沉淀在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物，做内源性免疫共沉淀。由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。取动物组织（脑、肝、脾等），切碎，匀浆，提取组织蛋白，进行免疫共沉淀实验。这一结果代表活体中蛋白质相互作用。4， 蛋白质细胞内定位实验17-22另一种经常用来检验蛋白质相互作用的方法是蛋白质细胞内定位技术。此法较为直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）。有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时，使得两种蛋白的分布发生变化。比如，某种蛋白也许在核内，当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时，有可能被转运到胞浆中。这种情况的共定位则较为典型。在进行蛋白质共定位（ 1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究此法也可称为活细胞定位。把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光荧光显微镜直接观测。 在进行精确细胞定位或共定位时，必须用共聚焦荧光显微镜观测。因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的 CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色。 如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色，就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用。普通荧光显微镜看到的是一个立体图象，无法确定蛋白质共定位现象。在进行定位或共定位同时，也可以对细胞核进行染色。这样，在细胞中就有三种颜色。细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置。上面介绍的活细胞定位，其优点是表达的荧光蛋白荧光强，没有背景，观测方便。但缺点是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白，实际上是两个融合蛋白。融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致，有待于进一步确定。而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点。（ 2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究免疫荧光的原理是，首先把细胞进行固定，然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内靶蛋白进行免疫反应，再用荧光素（如 FITC 和 TRIT