SIALC研究蛋白质相互作用原理.ppt

SILAC研究蛋白质相互作用 SILAC研究蛋白质相互作用 1：SILAC定量蛋白质组学原理 2：SILAC研究蛋白质相互作用原理 3：SILAC研究蛋白质相互作用文献 1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程 1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式 1.1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.2.1：培养基准备 材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。 培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。 1.2.2：细胞标记与测试 标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa. 标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，SDS分离，LC-MS/MS检测。 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 （1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS分离，染色。 （2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。 （3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL?)分析，数据检索。 1.2.4：结果形式 2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.1：SILAC研究蛋白相互作用原理 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用特点 2.3：SILAC研究蛋白质相互作用方法分类 2.3.1：Pull-down法 2.3.2: Tag-CoIP法 2.3.3：Bait-CoIP法 2.3.4：RNAi-Bait-CoIP 2.1：SILAC研究蛋白质相互作用原理 2.2：SILAC研究蛋白质相互作用特点 2.3 SILAC研究蛋白质相互作用方法分类 2.3.1：Pull-down法 2.3.2: Tag-CoIP法 2.3.3：Bait-CoIP法 2.3.4：RNAi-Bait-CoIP 2.3.5：上述四种方法比较 2.3.1 Pull down 法 2.3.4：四种方法比较 * * * 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 简介： SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞经传代培养5-6代后，蛋白质将被同位素稳定标记，等量混合标记的蛋白质后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 技术优势： 1：高通量，可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质； 2：定量精确，降低由于样品制备不同而造成的实验差异； 3：线性定量范围广； 4：灵敏度更高，蛋白质需要量明显减少； 5：标记采用的是体内标记技术，更接近样品真实状态。 SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、