DB37_T 576-2005饲料中盐酸克伦特罗快速筛选通则 酶联免疫吸附测定法.pdf

ICS65.120B20DB37山東东省地方标准DB 37/T 576—2015饲料中盐酸克伦特罗快速筛选通则酶联免疫吸附测定法General Rule of Clenbuterol Screening in Feeds Enzyme Linked ImmunosorbentAssay2006-01-23发布2006-03-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37 /T576—2005前言本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。本标准负责起草单位：山东省饲料监察所。本标准参加起草单位：北京望尔生物技术有限公司、无锡微生物研究所，本标准主要起草人：李俊玲、宫玲玲、强莉、李会荣、万宇平、王琳。 DB37/T576—2005饲料中盐酸克伦特罗快速筛选通则-一酶联免疫吸附测定法1范围本标准规定了用酶联免疫吸附法测定饲科中盐酸克伦特罗的方法，本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及添加剂预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速筛选，本方法最低定量限为10ug/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证，2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理利用物理方法将盐酸克伦特罗抗体吸附于固相载体表面，根据抗原抗体的特异性反应，加入标准或试科提取液及酵标盐酸克伦特罗抗原（已知抗原）与抗体进行特异性的免疫竞争反应。未反应的酵标物在洗涤中被清除，结合的酵标记物可以由显色物显示出来。显色的强弱与样品中的盐酸克伦特罗的量成反比。试剂和落液除非另有说明，本标准所用试剂均由试剂盒厂商提供，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。不同品牌试剂盒试剂组成略有差别。4. 1盐酸克伦特罗系列标准溶液4. 2抗盐酸克伦特罗的特异性抗体，4. 3酶标记抗原。4. 4显色剂。4. 5浓缩洗涤液。4. 6底物缓冲溶液，4. 7终止液。4. 8盐酸溶液，c（HC1）=1mo1/L4. 9氧化钠溶液，c (NaOH)=1mo1/L。5仪器设备5.1分析天平：感量0.01g。5.2酶标板。5.3离心机：2000r/min以上。5.4微量移液器：单道1100μL：多道50-250μL。1 DB37 /T576—200x5.5振荡器。5.6激涡振荡器。5.7酶标仪。5.8恒温箱。6试样的制备取饲料样品1000g，用四分法缩减分取200g左右，粉碎全部过0.45mm孔径筛，充分混勾，装入磨口瓶中备用。7测定步骤不同品牌的试剂盒其测定步露略有差别，使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整，7.1试料的提取称取2g试样（精确至0.01g），加入2ml1mo1/L盐酸，16ml水后摇均。涡旋3min，于振荡器上震荡15min。2000r/min离心20min，转移上清液并加入2nL1mo1/L氢氧化钠于上清液中混匀，使pH在6.5~7.5之间.2000r/min离心20min，转移出上清液（如果上清仍然混浊可提高转速或用滤纸过滤），用水稀释50倍，并混合均匀。取20μL进行分析。此时样品的移稀释倍数为500倍。7.2测试程序7.2.1将所用酵标板及所有试剂从冰箱中取出，使试剂盒温度升至20～24℃。注意每种液体试剂使用前均需辐匀7.2.2将足够标准和试样所用数量的孔条插入微孔架，每个试样和标准需做2孔。7.2.3加入20μL的试样和标准于各自的微孔中，每孔再加入80μL盐酸克伦特罗抗体溶液，7.2.4将微孔架置于37℃恒温箱中孵育30min后用工作洗涤液洗板，最后用吸水纸拍干。7. 2. 5每孔加入100口L酶标记的二抗落液，在37C孵育30min后用工作洗涤液洗板，段后用吸水纸拍干.7. 2. 6每孔加入显色剂100μL，轻轻震囊荡混勾，37C避光显色15min。7.2.7每孔加入终止液50μL，轻轻震荡混勾。7. 2. 8用目测法对样品孔的颜色和限量孔进行比较或用酶标仅进行测定，用酶标仪测定时，以零标准吸光度值A为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在2002000ng/L范围内是线性关系待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到盐酸克伦特罗的含量（m）：7. 3结果判定7. 3.1自测法：如果待测样品的颜色与阴性对照孔接近或更深，则判定该样品不含盐酸克伦特罗：如果待测样品比阴性对照孔浅，比限量孔深，则判定该样品含有盐酸克伦特罗，